基于穩定同位素自然豐度技術的土壤氧化亞氮產生與排放過程研究進展

黃 瑾，余龍飛，李文娟，黃 平

（1. 重慶交通大學 建筑與城市規劃學院，重慶 400074；2. 中國科學院 重慶綠色智能技術研究院，重慶400714；3. 中國科學院大學 重慶學院，重慶 400020；4. 暨南大學 地下水與地球科學研究院，廣東 廣州510632）

氧化亞氮(N2O)作為增溫潛勢極大的溫室氣體，對全球變化有著重要的影響，探究其源、匯關系意義十分重大。然而土壤N2O的源、匯具有很強的時空異質性，導致難以制定精準的N2O減排策略[1]。總的來看，土壤中N2O產生和排放過程復雜多樣。目前，大多數研究認為羥胺氧化、硝化細菌反硝化和反硝化過程是N2O產生的三大主要途徑[2?3]，而關于N2O還原過程的認識也還存在較大爭論，其中反硝化被認為是N2O還原的主導途徑[3]。為了量化上述N2O過程，有針對性地提出N2O減排策略，同位素分析技術在N2O溯源方面提供了重要支撐。同位素自然豐度法中的同位素異位體法，是一種非侵入性方法，因其不受底物同位素影響[4?5]，N2O同位素特征值δ15Nsp可被用作指示多種微生物產生N2O的作用過程[6?7]。N2O的其他同位素特征值，δ15Nbulk和δ18O也被用于指示N2O產生的微生物作用途徑，但會受到N2O 前體物 [銨離子 (NH4+)，硝酸根離子 (NO3?)和水 (H2O)等 ]的同位素組成的影響[6, 8?9]。已有很多學者探索利用同位素特征值來準確分析N2O產生的微生物過程，綜合研究δ15Nbulk、δ18O、δ15Nsp對揭示N2O產生機制更有重要的意義。而在N2O產生與排放過程中，不同功能微生物過程同位素分餾效應的差異構成了穩定同位素自然豐度技術分析微生物過程的基礎[10]，因此，同位素分餾是穩定同位素自然豐度技術應用的理論基礎，在研究中的作用不可忽視。本研究梳理了土壤N2O產生和排放過程中氮同位素分餾的效應；闡述了環境因子及微生物對土壤N2O產生和排放過程的同位素分餾效應影響；總結了穩定同位素自然豐度技術在土壤N2O源解析中的應用及進展。

1 土壤N2O產生和排放過程中的氮穩定同位素分餾

微生物參與的N2O轉化過程可分為4個經典過程，分別為硝化作用 (自養/異養硝化作用和硝化細菌反硝化作用)、反硝化作用 (真菌反硝化作用和硝態氮異化還原成銨)、硝化反硝化耦合作用和共反硝化作用。借助分子技術已基本確定控制硝化作用微生物過程的酶(編碼基因)，但仍需結合穩定同位素技術來分析具體的代謝過程[11]。氮同位素分餾作用是指隨著生物化學反應的進行，反應底物和產物δ15N豐度發生差異的現象，這是15N穩定同位素自然豐度技術應用的理論基礎[12]。本研究針對微生物驅動的硝化作用和反硝化作用的氮同位素分餾效應進行了梳理。

1.1 硝化作用

土壤硝化作用(nitrification)可分為自養硝化和異養硝化[13]。當前，自養硝化過程中的穩定同位素分餾得到了廣泛的研究。自養硝化作用是指NH4+或氨氣(NH3)經亞硝酸根離子(NO2?)氧化為NO3?的過程，包括羥胺氧化和硝化細菌反硝化2個部分。通過純培養實驗進行同位素檢測，獲得NH3或NH4+向羥胺(NH2OH)轉化以及NH2OH向NO2?轉化2個過程的同位素效應平均值，約(?29.6±4.9)‰。這2個過程主要涉及亞硝化單胞菌，其中歐洲亞硝化單胞菌Nitrosomonas europaea的氮同位素效應為 ?38.2‰～?24.0‰；而其他亞硝化單胞菌，包括亞硝化單胞菌N. eutropha、N. marina C-113a、Nitrosospira tenuis，其氮同位素效應范圍更大，為?38.2‰～?14.2‰[14?15]。僅 CASCIOTTI[16]對 NO2?向 NO3?的轉化過程做了同位素效應研究，同位素效應均值為(13.0±1.5)‰。在自養硝化過程中，N2O主要通過羥胺或NO2?的化學分解產生[17]，同位素效應值也會隨反應底物的不同而發生變化。NH2OH到N2O過程在純培養實驗中的同位素效應值為?26.3‰～5.7‰[18]，但后來有研究發現：將NO2?和NH2OH以1∶1混合作為反應底物，其同位素效應值變弱，為–17.8‰～0.8‰，比NH4+到N2O過程的表現得更弱，表明這些氧化過程會使同位素效應值減弱。僅以NH2OH作為底物來估算反應的同位素效應值，得出的結果為(?5.1±12.0)‰。

硝化細菌反硝化(nitrifier denitrification)是一種由氨氧化細菌(AOB)驅動的，但又有別于自養的氮轉化過程[10]，該過程中，NH4+或NH3氧化產生的NO2?被同一類氨氧化細菌進一步還原為N2O和氮氣(N2)[10]。該步驟涉及的酶和編碼基因與硝化作用和反硝化作用中參與相應步驟的酶和基因相同，因此該過程的同位素效應值可參考硝化作用和反硝化作用的相應過程。目前，關于硝化細菌反硝化過程能否還原N2O形成N2還存在爭議。有研究認為：AOB中并未發現編碼N2O還原酶同源物質的基因[19]，這表明硝化細菌反硝化過程可能不是N2O的還原過程；然而，BEYER等[20]認為：盡管傳統AOB中沒有發現N2O還原酶，但它存在類似N2O還原酶的電子銅蛋白亞硝基(nitrosocyanin)，這可能與N2O還原成N2有關，但其具體作用機制也還有待研究證實。

1.2 反硝化作用

土壤反硝化作用(denitrification)一般是指反硝化細菌在厭氧或微氧條件下將NO3?、NO2?或者N2O作為呼吸過程的末端電子受體，并將其還原為NO2?、NO、N2O或者是N2。N2O是反硝化過程的中間產物[4]，甚至某些條件下是反硝化的最終產物[21?22]。反硝化過程的N2O還原成N2是N2O消耗的關鍵過程，在調節自然生態系統N2O排放中扮演著重要角色[23]。在土壤培養實驗中，測得NO3?向NO2?轉化過程中的同位素效應值為?52.8‰～?10.0‰，平均值約 (?31.4±11.8)‰[24]。NO2?向 NO 轉化的同位素效應較弱，并且該過程以細菌和真菌參與的反硝化作用為主，同位素效應平均值約(?19.8±7.6)‰。NO向N2O轉化的同位素效應值為(14.0±1.6)‰[25]。OSTROM等[26]純培養實驗的研究結果表明：N2O還原為N2過程的同位素效應平均值為(?4.1±6.8)‰，但該過程同時存在正反2種同位素效應。在不考慮反向同位素效應時，其同位素值為?9.1‰～?2.5‰，平均值為 (?6.6±2.7)‰[18, 27]。

除細菌外，某些真菌(如尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum)也可以通過反硝化過程產生N2O，稱為真菌反硝化[28?29]。但真菌一般缺乏編碼N2O還原酶的基因，因而N2O是真菌反硝化的最終產物[28]。真菌反硝化作用對N2O排放總量的貢獻尚未完全闡明[30]，此過程的同位素分餾效應也有待進一步研究。

硝態氮異化還原成銨態氮的過程(DNRA)是指在厭氧環境、高pH以及大量的易氧化態有機物存在下，微生物以NO3?或NO2?作為電子受體，還原成可利用性NH4+，將活性氨滯留在生態系統中的過程。NO3?還原成 NO2?后，NO2?主要還原成 NH4+并且伴隨 NO2?的短暫積累和 N2O的產生[31]。其中 N2O 是該過程中NO2?還原的副產物[32?33]。實際上，自然環境中DNRA過程對N2O排放的貢獻研究仍然較少。有一些研究認為：DNRA過程在N2O產生和排放中所占的比例較小，甚至可被忽略[34]。NO3?還原為 NO2?過程的同位素效應值也為(–31.4±11.8)‰[24]。但目前亞硝酸鹽還原為銨鹽這一關鍵反應的同位素效應值尚不清楚。此外，一些DNRA過程細菌，如Wolinella succinogenes和Anaeromyxo bacterdehalogenans也具有編碼N2O還原酶的基因，這可能對N2O還原具有潛在貢獻，但其確切過程還需進一步證實[33,35]。

2 土壤N2O產生和排放過程中與同位素分餾效應有關的主要因子

土壤產生N2O是復雜的微生物過程，研究多個影響因子協同作用對N2O排放量變化的影響，有助于了解N2O排放的內在機制[5, 36]。在N2O轉化過程中，不同微生物同位素分餾的差異構成了同位素手段分析微生物過程的基礎[10]。在純培養實驗中(如真菌純培養實驗)，同位素效應的可變性可能是因不同的微生物菌株或多種微生物導致，也可以由特定微生物的同位素效應來解釋，例如，脫氮副球菌的值在–28.6‰～–10.0‰之間變化很大[18]。不同菌株之間的部分變異性可能來自不同的酶結構[15]，但單個微生物體測定值出現的巨大變化表明特定的實驗條件(如擴散底物的可用性、中間產物的積累等)對特定的同位素效應起著重要作用[18]。

同位素分餾效應主要受到反應平衡條件以及反應速率的影響(圖1)。而環境因素的改變(如土壤溫度、水分等)會影響反應速率，并進一步對微生物的生理過程、群落組成和反應活性產生影響，進而影響N2O的產生和排放過程及同位素分餾效應。關于實驗的環境條件(如溫度、濕度、底物濃度等)與同位素效應之間的關系，有少部分學者開展了相應的研究。MARIOTTI等[37?38]研究了同位素效應對溫度的依賴性，他們在土壤培養實驗中觀測到30 ℃下同位素分餾效應(?24.6‰)明顯弱于10 ℃下的值(?31.2‰)。較高反應溫度下反應速率較快，導致生成物轉化效率高并使得同位素分餾效應較小[39]；而在低溫下的反應進程緩慢，通過擴散傳遞的底物相對較高，因此表現出更強的酶同位素效應。MATHIEU等[40]還通過在底物中添加NO3?來研究同位素組成的影響。隨著底物消耗量的增加，培養實驗中也觀察到了同位素效應的降低[41?42]。當同位素效應轉移到擴散的較弱同位素效應時，會導致同位素效應減少[37]。然而，在不同濕度和溫度條件下使用山地和濕地進行的土壤培養實驗結果相互矛盾[39]，反應速率與同位素效應差異之間沒有顯著關系。其中，各處理間的反硝化速率相差1個數量級以上，但測定的同位素效應相差不到9‰。以上研究說明：同位素分餾效應(尤其是野外環境)的評估依然具有較大不確定性，除反應速率之外可能還存在其他制約因子，比如功能微生物群落構成、微生物活性等。

圖1 微生物驅動的土壤N2O產生和排放過程中的同位素分餾效應Figure 1 Isotope fractionation effects in N2O production process driven by microbe

3 穩定同位素自然豐度技術在土壤N2O溯源中的應用及進展

穩定同位素自然豐度技術是指利用N2O的15N和18O的自然豐度變異來研究N2O的產生、排放過程[43]。N2O自然豐度作為N2O源和匯的一種更綜合的示蹤劑，已廣泛用于土壤N2O源解析[44?45](圖2)。然而，由于δ15Nbulk和δ18O往往依賴于底物的同位素組成，且各個過程中同位素分餾效應存在不確定性，很難通過δ15Nbulk和δ18O的變異準確解釋N2O排放來源[5, 45]。

圖2 穩定同位素技術在 N2O溯源中的發展Figure 2 Development of stable isotope techniques in N2O source partioning

同位素異位體法是在穩定同位素自然豐度技術上發展起來的，但不同于穩定同位素自然豐度技術，同位素異位體法(δ15NSP)[46]并不受到底物同位素豐度影響，在N2O擴散過程中相對穩定[47?48]，其僅受N2O形成的機制和途徑[49]以及N2O還原過程的影響。此項優點為高精度N2O溯源提供基礎，且不干擾系統、適用于田間試驗，此外還提供了估算DNRA過程產生N2O的潛力[5]。N2O分子為不對稱的直線型結構，其分子式為N=N=O，中間和邊緣不同的氮原子被分別稱為α原子和β原子[50]。N2O的各產生途徑因受不同的微生物或酶調控，造成N?O鍵的斷裂位置不同，故生成的N2O的SP值也有所差異，這被認為是運用同位素異位體法溯源N2O產生途徑的理論基礎[45]。同位素異位體法N2O分子中SP值可以判別兩部分N2O產生過程，一部分為硝化細菌硝化作用和真菌反硝化作用產生的N2O過程(N2ON)，另一部分為硝化細菌反硝化作用和反硝化作用產生的N2O過程(N2OD)。同位素異位體法已經開始被用來區分土壤中N2O各產生過程的微生物來源[7?9]，表現出良好的應用前景。

然而，僅使用δ15NSP進行源解析也會面臨一些問題：①N2O還原過程中SP值的增加，即N2O還原過程中的同位素分餾效應。②真菌反硝化作用和硝化作用的SP值重疊。③不同培養物和反應過程中SP的變異性。此外，正如MOHN等[51]所證明的，由于不同的分析技術和缺乏可用的N2O同位素標準物質，可能導致不同實驗室間SP值測定結果有較大差異。雖然國際上已發布2個N2O同位素標準樣品USGS51和USGS52[52]，但有關野外同位素值的測定仍有待確定。為了解決上述問題，很多學者在不斷探索。問題①可以在模型中解決，因為有研究表明：在N2O還原為N2的情況下，SP的同位素效應穩定范圍為?8‰～?2‰[47, 53?54]。但問題②尚未解決。有研究[25, 55?56]表明：SP在反應過程中是穩定的，但鑒于P450nor真菌一氧化氮還原酶還原氧化氮(NO)過程中SP從15‰增加到29‰，SP值的穩定性可能需要進一步證實，這也是問題③有待解答的問題，不同培養物中不同的酶和N2O之間存在的特定偶聯機制。

為了更準確地測定N2O還原程度和微生物貢獻，實際應用中通常采用雙同位素圖譜法[28, 57?58]，即使用δ18O/δ15Nbulk、δ15NSP/δ15Nbulk或δ15NSP/δ18O，即用2個同位素特征值來評估N2O不同產生途徑的貢獻率和N2O的還原程度。WRAGE等[17]使用了δ18O/δ15Nbulk進行硝化、硝化細菌反硝化及反硝化過程產生N2O的來源區分。但在實驗環境中水的18O與土壤中O2以及NO3?存在發生氧交換的風險，導致結果分析不準確。H2O中氧原子會與NO2?和NO3?中氧原子發生氧交換，且它們對N2O中氧原子的貢獻與微生物種類有關。因此，需要考慮自然條件下氧交換對δ18O值的影響。KOOL等[59]使用富集比保留值法(ERR)對反硝化過程中的氧原子交換進行了測定，盡管有待改進，但這種方法能夠區分硝化、硝化細菌反硝化、硝化反硝化耦合作用等N2O生產過程，并應用于一系列土壤。TOYODA等[57]首次將δ15NSP/δ15Nbulk應用于農業土壤。之后，有研究[59?62]利用這種關系來確定N2O混合比例和N2O還原程度，發現δ18O也可以很好地示蹤N2O的產生過程，這得益于細菌反硝化期間高的氧原子(O)交換量，從而使該途徑的δ18O值非常穩定。基于這一發現，LEWICKA-SZCZEBAK等[63]提出了解析N2O源過程的δ15NSP/δ18O圖，可用于校正反硝化作用中N2O還原的影響和定量微生物作用貢獻，最近已經廣為應用[64?66]。δ15NSP/δ15Nbulk和δ15NSP/δ18O已聯合應用于現場研究[65]，并在計算N2O還原程度和真菌、細菌反硝化值之間顯示出較好的一致性。但利用雙同位素圖譜法在精確量化N2O產生的路徑比例和N2O還原程度方面仍存在許多限制，比如單一產生路徑的同位素特征值范圍廣、不同產生路徑的同位素特征值范圍的重疊、反應底物同位素組成的變化，以及與N2O還原相關的分餾因子的可變性等。因此基于雙同位素圖譜法所提供的定量結果的準確性仍有待探究。

最近，LEWICKA-SZCZEBAK等[67]在雙同位素圖譜法的基礎上，把3個同位素特征值(δ15Nbulk、δ18O、δ15NSP)結合起來計算N2O不同產生途徑的貢獻率和N2O的還原程度。提出了一種基于三維同位素的復雜模型，并對其結果進行了驗證。這是首次在實驗室和田間條件下對N2O同位素自然豐度法溯源N2O進行系統地驗證研究。然而將N2O同位素特征值完全整合到模型中，需要建立一個包含同位素效應及其不確定性的綜合數據庫[18]。

4 總結與展望

未來關于穩定同位素技術在土壤N2O溯源中的研究需注意以下幾個方面：①同位素自然豐度法在N2O溯源應用中還有很大的提升空間。ZHANG等[68]指出：需要進一步探究同位素特征值穩定性來提高對 N2O微生物過程的識別。把同位素特征值 (δ15Nbulk、δ15NSP、δ18O)與底物同位素 (如 δ15、δ15、δ18、δ18)相結合，分析反應底物在N2O生成過程中的分餾效應可以提高源解析的準確性[69]。把N2O的δ15Nbulk、δ18O、δ15NSP同位素特征值結合起來有益于識別未知源[70]，但在不同的pH、氧化還原狀況、基質以及非生物N2O產生途徑的條件下測得不同的δ15NSP，說明同位素效應及其變異性是制約精確度的關鍵，其中微生物過程及其導致的同位素分餾效應是N2O溯源的重要切入點。此外，目前對于18O富集系數ε18O的研究還相對較少，且一些研究認為：不同過程產生N2O的δ18O無明顯區別[39]，這表明對δ18O的特征值研究有助于準確解析N2O的來源。并且未來還需對N2O產生過程中每一步的δ15NSP都進行測定，探究環境因素與產生N2O具體的生化過程速率之間的關系(包括共反硝化)，在排除共反硝化的影響下，對真菌反硝化的δ15NSP進行改善[56, 71]。②除了N2O轉化過程中同位素分餾效應會導致誤差外，N2O同位素的分析和測定也需要標定和校準[72?73]。OSTROM等[52]提出2種N2O氣體標準物質USGS51和USGS52用于實驗室標定和校準。未來仍需要多個實驗室間進行更多平行比較并制定統一的校準方案，如對團簇同位素的精確測定有助于質譜值重疊樣品的校準。③新方法的探索。穩定同位素技術與分子技術結合[74]。很多研究都提出應該把δ15N與qPCR、基因拷貝數的測定等分子技術相結合來對N2O生物過程進行區分，并且可以結合微生物生態學分析和量化N2O∶N2的產生和不同微生物N2O來源之間的分配[75?79]。另外，團簇同位素特征值的方法也開始流行。SP值不能用于區分硝化和真菌反硝化產生N2O的過程，但是可以使用團簇同位素特征值的方法，通過具體產生途徑中特定的酶來判斷[80]，但如何準確判斷特定的酶仍需要進一步的探索。