分子對接和定點突變提高內切菊粉酶的催化活力

包敏,鈕成拓,陳玙捷,鄭飛云,王金晶,劉春鳳,李崎*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 2(江南大學,釀酒科學與工程研究室,江蘇 無錫,214122) 3(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

低聚果糖是指果糖經β-2,1糖苷鍵連接而成的,聚合度為2～9的功能性低聚糖[1]。作為一種強效益生元,它可以促進腸道內益生菌的增殖[2],降低血脂、預防高膽固醇[3],促進礦物質的吸收[4],有助減肥和預防糖尿病,并可以增強機體免疫力[5]。因此,低聚果糖常被添加于牛奶制品、調味品、嬰幼兒食品及飼料中,在食品、保健品等領域應用廣泛。

低聚果糖在洋蔥、蒜、甜菜和一些谷物中廣泛存在,但含量并不高,且提取難度較大。目前市場上售賣的低聚果糖主要是利用生物酶技術——果糖基轉移酶(EC 2.4.1.9)或內切菊粉酶進行生產。果糖基轉移酶在反應過程中形成的副產物葡萄糖不僅增加了下游純化工藝的成本,同時也抑制了果糖基轉移酶的活性,阻礙蔗糖的進一步轉化,產物含量低(<55%)且生產成本高[6]。內切菊粉酶(endo-inulinase,EC 3.2.1.7)能隨機催化水解菊粉內部的β-2,1糖苷鍵,產生三糖、四糖、五糖等低聚果糖[7]。使用內切菊粉酶生產低聚果糖操作簡單,副產物少,產率高達90%,具有很高的商業應用價值[8]。

目前,我國內切菊粉酶的催化活力難以達到工業化生產的要求,且相關研究主要集中于野生菌的篩選、基因的克隆表達及酶學性質研究,關于內切菊粉酶催化機制及三維結構改造的研究則相對較少[7]。隨著生物信息學和分子生物學的高速發展,如何提高內切菊粉酶的催化活力也有了新的研究思路。如同源建?？梢院唵螠蚀_地根據已知的蛋白質結構模型預測目標蛋白的三維結構[9],分子對接則可以幫助理解蛋白與底物的相互作用方式,指導人們理性選取氨基酸改造靶點,有效地對蛋白質進行改造[10]。

2012年,內切菊粉酶晶體結構首次被解析[11],該蛋白來自Aspergillusficuum,至今仍是唯一被解析的內切菊粉酶晶體。為了進一步提高內切菊粉酶的催化活力,本研究以該晶體作為模板,對來源于LipomycesstarkeyiNRRL Y-11557的內切菊粉酶INU3B[12]進行同源建模,并以蔗果五糖(GF4,G代表葡萄糖,F代表果糖)作為底物進行分子對接,確定INU3B結合口袋處的關鍵氨基酸。在此基礎上,將關鍵氨基酸突變為丙氨酸來擴大底物結合口袋,以期提高酶催化活力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組質粒pET22b(+)-inu3B為本實驗室前期構建,并克隆至大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中保存[12]。重組大腸桿菌的培養采用Luria-Bertani (LB)培養基:NaCl 5 g/L,蛋白胨 10 g/L,酵母提取物 5 g/L。

E.coli感受態細胞制備試劑盒,大連TaKaRa生物工程有限公司;質粒提取劑盒、Cycle Pure試劑盒等,OMEGA Bio-tek公司;氨芐青霉素、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG),生工生物工程(上海)股份有限公司;SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒,上海碧云天生物技術有限公司;用作底物的菊粉(I2255),Sigma公司;KH2PO4、K2HPO4·3H2O、NaCl、甘油、胰蛋白胨等其他試劑,國藥集團有限公司。

1.2 儀器與設備

T100 Thermal Cycle PCR儀,美國Bio-Rad公司;GelDoc-ItTM凝膠成像系統,美國UVP公司;Nano Drop 2000微量分光光度計,美國Thermo Fisher Scientific公司;HYL-C3組合式搖床,太倉市強樂實驗設備有限公司;Sonics Vibra-Celltm超聲破碎儀,美國Sonics公司;MR-96T型智能酶標儀,騁克儀器(上海)有限公司;XMTD-204數顯式恒溫水浴,上海博訊醫療設備廠;Powerpac Basic蛋白電泳儀,美國Bio-Rad公司;冷凍離心機,德國Eppendorf公司;KTA蛋白純化系統,美國GE 醫療公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 內切菊粉酶的同源建模

采用SWISS-MODEL在線程序 (https://swissmodel.expasy.org/)建模,相似性>30%的蛋白質為同源模型的候選參考蛋白質。利用評估程序ProCheck (https://servicesn.mbi.ucla.edu/PROCHECK/)對模型可靠性進行評估。用軟件Pymol對目標蛋白的三維模型進行結構分析。

1.3.2 GF4與內切菊粉酶的分子對接

受體結構:用AutoDockTools 1.5.6對同源建模得到的蛋白質結構進行去水、加氫等處理,保存蛋白原有電荷,采用剛性對接,生成pdbqt文件。

配體結構:通過Chem3D繪制并生成小分子配體蔗果五糖GF4的三維結構。用AutoDock Tools 1.5.6 處理后,生成pdbqt文件。

選定對接區域:通過結合口袋對接,確保選定的蛋白區域完全包裹催化三聯體。

分子對接:調動相應的代碼,采用AutoDock Vina[13]進行對接。

1.3.3 定點突變

以質粒pET22b(+)-inu3B為模板,加入相應的突變引物(表1),用高保真聚合酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase進行PCR擴增。從E.coli中提取的質粒被甲基化,用DpnI對PCR產物進行處理排除模板的干擾后通過cycle pure純化回收,并轉入E.coliBL21(DE3)感受態細胞中。選取陽性轉化子提取質粒送測序公司測序。

表1 突變引物序列Table 1 List of primers used for site-directed mutagenesis

1.3.4 重組菌的誘導表達

將突變后的重組E.coli接種至50 mL含氨芐青霉素的LB液體培養基中,37 ℃、180 r/min培養12 h后以2%的接種量轉移至50 mL新鮮的TB培養基中。37 ℃、180 r/min培養約2 h (OD600約為0.6～1.0)后加入誘導劑IPTG至終濃度為0.1 mmol/L,轉移至20 ℃、180 r/min誘導20 h。

1.3.5 重組菌粗酶液的提取

取誘導培養后的發酵液30 mL,3 000×g離心5 min后收集菌液,加入15 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)重懸清洗,5 000×g離心5 min,棄上清液后再加入15 mL相同的緩沖液。冰浴條件下超聲波細胞破碎,300 W,超聲3 s、間隔7 s,120次。破壁后,4 ℃,5 000×g離心10 min,上清液即為粗酶液,用于下一步純化。

1.3.6 重組內切菊粉酶的純化

1.3.7 酶活力測定

采用DNS法測定內切菊粉酶酶活力[14]。取200 μL純化后的酶液與800 μL 20 g/L的菊粉混合,70 ℃水浴反應10 min 后加入1 mL DNS試劑停止反應。沸水浴10 min,取出冷卻至室溫,取1 mL反應液加蒸餾水稀釋一定的倍數并在540 nm波長下測量吸光度。根據果糖標準曲線計算生成的還原糖的量。通過Bradford方法測量蛋白質濃度,牛血清白蛋白用作標準蛋白質[15]。

內切菊粉酶活力的定義為:在pH為5.5、溫度為70 ℃的條件下,每分鐘水解菊粉生成1 μmol還原糖所需的酶量(mg)為1個酶活力單位(U)。

2 結果與討論

2.1 內切菊粉酶INU3B的同源建模

將來自L.starkeyiNRRL Y-11557的內切菊粉酶INU3B的氨基酸序列上傳到Swiss-Model 蛋白模擬在線服務器。INU3B與來自A.ficuum的內切菊粉酶(3 sc7.1.A)同源性達68.1%,以它為模板進行同源建模,圖1為INU3B獲得的三維結構。內切菊粉酶屬于糖苷水解酶第32家族,它的三維結構具有該家族的共同特點,N端由5個葉片形成的封閉催化活性口袋,每個葉片包含4個反向平行的β-折疊片,形成經典的“W”拓撲結構;C端由2個反向平行的β折疊片組成,每個β折疊片包括6個β折疊股,組裝成類似三明治的結構[16]。其中,Glu48(WMNDEPNG)是親核試劑,Asp181(RDP)是過渡態穩定劑,Glu238(EVP)是酸/堿催化劑,這3個氨基酸構成了內切菊粉酶的催化三聯體,負責底物的結合和催化[16],以藍色棍棒模型進行標識。催化三聯體對蛋白活性起著至關重要的作用,對這3個位點的突變常常會導致酶的完全失活[17]。

圖1 INU3B的同源建模結構Fig.1 Homology model for 3D structure of INU3B

利用評估程序ProCheck對INU3B蛋白模型的可靠性進行評估,結果如圖2-a所示:88.1%位于最適區域,10.2%位于其他允許區域,1.5%位于一般允許區域,1個殘基(0.2%)位于不允許區域,說明該模型基本合理。對INU3B進行表面電勢分析,如圖2-b所示,INU3B活性口袋的表面具有較強電負性,有利于底物穩定結合在酶的活性空腔中。

a-Ramachandran圖;b-表面電勢分析圖2 INU3B的Ramachandran圖和表面電勢分析Fig.2 Ramachandran plot and potential diagram of INU3B

2.2 INU3B與GF4的分子對接

以INU3B催化三聯體所在區域為對接盒子,通過Autodock Vina對INU3B和底物分子GF4進行對接,選出最合理的構象。結果如圖3-a所示,GF4深入到INU3B結合口袋內部,與口袋良好匹配。利用Pymol進行分析,INU3B底物結合口袋中距GF4分子4 ?以內的氨基酸殘基共25個。其中,N47、Y133、Q140、E238、N270、N325能與GF4形成氫鍵,如圖3-b所示,這些氨基酸可能在酶與底物的結合和催化過程中起著重要作用。

2.3 突變位點的選擇

丙氨酸(Ala)是一種不帶電荷的疏水性氨基酸,側鏈為甲基,具有較小的空間位阻,對蛋白質的結構影響較小[18]。內切菊粉酶的底物為菊粉,菊粉是由果糖構成的線性直鏈多糖,末端帶有1個葡萄糖,聚合度高、分子量大[19-20],因此猜測將相關位點突變為丙氨酸可以增加底物結合口袋,從而有效地提高內切菊粉酶的活力[21]。

a-INU3B-GF4復合體的對接模型;b-INU3B與GF4的氫鍵作用圖3 GF4與INU3B的相互作用Fig.3 The interaction between INU3B and GF4

通過序列比對(圖4),對結合口袋處的25個氨基酸進行保守性分析。結果如表2所示,大多數氨基酸都具有一定的保守性。在進化過程中絕對保守的氨基酸一般有著重要作用,因此不突變。而保守性極低的氨基酸,在催化過程中發揮的作用相對較小,因此不突變。對能與底物分子形成氫鍵的6個氨基酸的位點的突變往往會造成酶活力的降低,因此不突變。由于G73、A262、G328原來的側鏈就比較小,因此也不進行丙氨酸突變。因此,最終選擇了7個氨基酸位點(M46、F104、T105、V239、T260、S326、Y327)分別進行丙氨酸突變。

圖4 內切菊粉酶的氨基酸序列比對Fig.4 A snapshot of alignment of endo-inulinase amino acid sequences注:組成結合口袋的氨基酸用*標出

表2 底物結合口袋氨基酸的保守性分析Table 2 Conservative analysis of amino acids in substrate-binding pocket

2.4 突變體的構建與分析

以pET22b(+)-inu3B為模板進行全質粒擴增,PCR產物經DpnI處理后轉化至感受態中,挑選陽性轉化子測序后獲得相應的突變體。正確點突變的重組E.coli誘導表達后,進行純化、脫鹽,并進行SDS-PAGE驗證。從圖5可以看出所有重組蛋白均為單一條帶,可用于進一步分析。

M-蛋白質marker;1-7:INU3B、M46A、F104A、T105A、V239A、T260A、Y327A圖5 INU3B與突變酶的蛋白電泳分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of INU3B and mutants

對純化后的突變蛋白進行酶活力測定,實驗結果如圖6所示。大部分突變體的催化活性大幅下降,突變體F104A、T260A、S326、Y327A幾乎檢測不到酶活性,突變體T105A、V239A對底物的活力遠小于INU3B。7個突變體中僅M46A酶活力提高了22%,比酶活達到2 611.40 U/mg。將內切菊粉酶INU3B的晶體結構提交至Eris (https://dokhlab.med.psu.edu/eris/login.php)[22]在線服務器預測M46A突變對熱穩定性的影響，該突變使得氨基酸的去折疊自由能下降,ΔΔG為-2.72 kcal/mol,因此該突變很可能增加酶的熱穩定性,這在工業應用上十分有利。

圖6 INU3B及突變體內切菊粉酶活力測定Fig.6 The specific enzyme activity of INU3B and mutant endo-inulinases generated by site-directed mutagenesis

M46位于結合口袋的底部且指向外部 (圖7)。野生酶中M46與K337形成一個氫鍵,突變后A46仍然能與K337形成氫鍵,氫鍵的位置不變,突變未對在46 位的氨基酸的氫鍵相互作用產生明顯的影響。有文獻指出,Ala主要通過空間效應而非形成氫鍵或疏水鍵來調節酶活性[18]。因此推測,該位點突變為丙氨酸后側鏈變短,減小了結合口袋的外表面積、體積和深度(圖7),一定程度上使INU3B-GF4復合體結構更為緊湊,增強了底物與酶結合,從而增強了催化活力。

a-INU3B;b-M46A圖7 INU3B和突變體M46A結合口袋的形態Fig.7 Shape of the binding pocket for INU3B and mutant M46A

F104、T260、S326、Y327位于結合口袋的側面(圖8),與底物分子較近。這些位點通過自身或者相互作用來形成穩定的結構,對結合口袋的構象有著關鍵的作用。F104的側鏈較長且指向口袋內部,這縮短了與底物分子的距離,同時側鏈末端的苯環為口袋的結構提供了支撐。因此突變之后,結合口袋的結構遭到破壞,酶活急劇下降。S326、Y327位于loop環上,共同組成了口袋末端,把底物限制在里面,突變成丙氨酸后,降低了酶-底物復合體的緊密度和穩定性從而降低了酶活性。

圖8 突變位點在結合口袋中的位置 (突變氨基酸用紫色標出)Fig.8 All mutants in the binding pocket

T105、V239位于結合口袋的凹槽底部(圖8),與底物分子相對較遠。所帶的側鏈基團也相對較小,突變成丙氨酸后對空間位阻影響不大。此外,比較發現突變前后氫鍵數量幾乎沒有減少,這也可能是其突變后仍保留了部分酶活性的原因。無論如何,這些負突變的形成表明了結合口袋附近的氨基酸對內切菊粉酶催化活性具有重大影響。

3 結論

本研究通過同源建模構建INU3B的三維蛋白結構模型,并與GF4進行分子對接。分析底物結合口袋的氨基酸,并進行丙氨酸突變以增大結合口袋,篩選獲得了唯一的正向突變體M46A,比酶活力達2 611.40 U/mg,是原始酶INU3B的1.26倍。此外,其余6株突變體的酶活力均呈現不同程度的下降,說明結合口袋附近的氨基酸對內切菊粉酶催化活性影響重大。深入了解酶的結構與功能有助于指導酶分子進行定向改造,將是提高內切菊粉酶催化活力和低聚果糖的產量的有效途徑。后續可以深入探究M46突變成丙氨酸后對酶學性質及功能的影響,同時可以在此基礎上對結合口袋處的關鍵氨基酸進行飽和突變以深入解析相關功能。