TLR4 mRNA和TCF21 mRNA在喉癌組織中的表達及其與臨床病理的相關性

楊湘，馬鵬，馮俊

(南充市中心醫院耳鼻咽喉頭頸外科，四川 南充 637000)

喉癌是臨床較常見的咽喉惡性腫瘤，發生率占全身惡性腫瘤的5%～7%，且有侵襲能力強、易復發、易轉移、預后差等特點，嚴重威脅著患者身心健康[1]。早期喉癌采用手術、放化療、基因療法等綜合手段進行治療，可獲得較好的療效，但大多數患者在確診時病情已進展到中晚期，療效欠佳。因此，了解喉癌的生長、轉移機制，及早確診對于患者治療及預后改善具有重要的意義。近年來，隨著喉癌發生率逐漸升高，惡性腫瘤發生發展的分子機制引起學者的重視。TOLL樣受體(TLRs)是核因子κB(NF-κB)的潛在激活劑，已有大量研究證實其是炎癥病變與惡性腫瘤發生間的橋梁[2]，在胰腺癌、肺癌中呈高表達[3]。轉錄因子21(TCF21)屬于堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)蛋白家族成員之一，對促進細胞生長、分化具有一定的調控作用，當前已被證實其在肺癌、乳腺癌、腎癌等多種癌癥中可作為抑癌基因參與腫瘤發生發展[4]。然而，關于TLR4、TCF21在喉癌中的具體表達情況及其臨床意義、相關機制等仍未明確。本研究旨在探究TLR4 mRNA、TCF21 mRNA在喉癌組織中的表達情況，初步分析潛在機制，為喉癌的臨床診斷及治療提供新依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2018年11月至2020年6月南充市中心醫院收治的95例喉癌患者為研究對象，術前均完善頸部增強CT、電子纖維喉鏡、病理活檢確診為喉鱗狀細胞癌，且在手術前未接受過放化療。其中男性86例，女性9例；年齡45～76歲，平均(58.09±7.55)歲；癌癥位置：聲門型59例，聲門上型30例，聲門下型6例；組織學分化：低分化40例，中分化29例，高分化26例；淋巴結轉移情況：N037例，N136例，N222例；浸潤深度：T1～269例，T3～426例；臨床分期：Ⅰ期41例，Ⅱ期34例，Ⅲ期12例，Ⅳ期8例。在手術過程中，留取喉癌組織以及距離喉癌3～6 cm的癌旁正常組織作為實驗樣本，樣本取出后迅速將其存放到裝有RNALATER溶液的凍存管中中，在-80 ℃中保存備用。

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 PCR擴增儀(美國應用生物系統公司)；微量高速離心機(上海錦玟儀器設備有限公司)；可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)。TRIzon總RNA提取試劑(上海聯邁生物工程有限公司)；TCF21、TLR4引物序列(上海英駿生物技術有限公司)；cDNA第一鏈合成試劑盒(上海烜雅生物科技有限公司)；invitrogen反轉錄試劑盒(北京優尼康生物有限公司)；cDNA逆轉錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)。

1.2.2 TLR4 mRNA、TCF21 mRNA表達水平測定 采用RT-PCR技術，具體如下：(1)總RNA提取：提取樣本組織中的中RNA，嚴格按照TRIzon總RNA提取試劑說明書進行操作。取2 μL RNA樣本，用SP-723/723 PC可見分光光度計在260 nm下的吸光度測定定量樣本組織中定量RNA濃度。檢測RNA在260 nm、280 nm下的吸光度分析RNA純度測定，記錄OD260/OD280，所有樣本的OD260/OD280比值要求為1.7～2.0，低于此必須提示提取的RNA含有蛋白質雜志，需應用氯仿重新提純。同時應用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。(2)cDNA合成：以總RNA作為模板，應用invitrogen反轉錄試劑盒合成cDNA。取0.2 mL經DEPC處理過的PCR管，冰浴條件下在PCR管內配置反轉錄反應液。(3)RT-qPCR反應：按照cDNA逆轉錄試劑盒說明書進行TLR4和TCF21引物合成操作。在PCR管內依次加入：1 μL反轉錄產物，基因上游與下游引物各0.25 μL，PCR反應mix12.5 μL，并加入ddH2O是管內溶液體積達到25 μL。混勻PCR管內溶液，將其置于PCR儀中按照反應條件(95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 45 s，共28個循環)完成RT-qPCR反應。反應結束后，將樣品存放到-20℃冰箱中備用。內參GAPDH引物(擴增片段116 bp)，上游序列：5′-CTC AGA CAC CAT GGG GAA GGT GA-3′,下游序列：5′-ATG ATC TTG AGG CTG TTG TCA TA-3′；TLR4引物(擴增片段356 bp)，上游序列TLR4：5′-GCC GGA AAG TTA TTG TGG TGG T-3′，下游序列：5′-ATG GGT TTT AGG CGC AGA GTT T-3′；TCF21引物(擴增片段127bp)，上游序列：5′-TGC GTT CGC TAC ATA CAA GGT G-3′，下游序列：5′-TCT GTG ACT TGG CGT CTC GG-3′。(4)計算TLR4 mRNA、TCF21 mRNA表達水平：同一樣本不同基因在不同PCR管中機械能，擴增后對擴增曲線、溶解曲線進行分析，獲得循環閾值(CT值)，最后通過2-△△Ct法計算TLR4 mRNA、TCF21 mRNA在喉癌組織內相對表達水平(△△Ct值=喉癌組織△Ct(目的基因)-癌旁組織△Ct(目的基因，△Ct值=Ct目的基因-Ct內參基因)。

1.3 觀察指標

(1)喉癌組織、癌旁組織中TLR4 mRNA、TCF21mRNA表達水平；(2)TLR4 mRNA、TCF21 mRNA表達水平與喉癌患者組織分化程度、淋巴結轉移情況、臨床分期、病理特征、浸潤深度等臨床病理特征的關系。(3)喉癌組織中TLR4 mRNA、TCF21 mRNA表達水平的相關性。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 喉癌組織與癌旁組織TLR4 mRNA、TCF21 mRNA表達水平比較

喉癌組織的TLR4 mRNA表達水平高于癌旁正常組織(P<0.05)，而喉癌組織TCF21 mRNA表達水平較癌旁正常組織降低(P<0.05)。見表1。

表1 喉癌組織與癌旁組織TLR4、TCF21mRNA表達水平比較

2.2 喉癌組織不同病理特征TLR4、TCF21mRNA表達水平比較

在喉癌組織中，TLR4 mRNA、TCF21 mRNA表達水平與癌組織分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期的差異有統計學意義(P<0.05)，而在病灶位置、腫瘤大小、病理形態的差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 喉癌組織不同病理特征TLR4、TCF21mRNA表達水平比較

2.3 喉癌組織中TLR4 mRNA、TCF21m RNA表達水平與各種病理特征的相關性

相關性分析顯示，喉癌組織中TLR4 mRNA表達水平與癌組織分化程度呈負相關，與浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期呈正相關(P<0.05)；TCF21 mRNA表達水平與組織分化程度呈正相關，與浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期呈負相關(P<0.05)；癌組織的TLR4 mRNA表達水平與TCF21 mRNA表達呈負相關性(r=-0.454，P<0.001)。見表3。

表3 喉癌組織中TLR4、TCF21mRNA表達水平與各種病理特征的相關性

3 討論

在臨床上，早期喉癌容易被漏診，但此階段的病灶經手術、放化療治療后往往會達到臨床治愈的標準，而中晚期喉癌雖易確診，但患者即使進行綜合手段治療后仍會有呼吸、吞咽、發音功能障礙等問題，使其生存率、生存質量嚴重降低[5]。因此，早期診斷早治療至關重要。當前，關于喉癌病因的相關研究報道較多，但其分子機制尚無明確的研究結果，而且針對喉癌的基因療法、靶向治療效果仍有效，故在分子水平上對喉癌的發生、發展機制進行研究為臨床熱門話題，能夠在一定程度上提升喉癌的診治水平[6]。

文獻報道[7]慢性炎癥可顯著升高癌癥的發生風險，Toll樣受體(TLR)家族為參與非特異性免疫的模式識別受體，其能夠介導機體免疫反應、慢性炎癥反應的發生發展而且對腫瘤生物學特性也有一定的影響[8]。TLR4為Ⅰ型跨膜蛋白受體，定位于17號染色體，TLR4在前炎性因子與特異性配體結合后可被激活，使TLR4信號傳導至下游通路，促使炎癥反應發生，與此同時也能夠誘導細胞增殖、分化[9]。大量研究證實TLR4可經過多種方式參與腫瘤發生、發展[10]。相關研究[11]指出，炎性配體可通過TLR4信號通路使體內的NF-κB被激活，進而參與炎癥發展為腫瘤這一病理過程。Galle等[12]研究顯示，HSP70 1A蛋白為炎癥的內生性配體之一，其能夠促使癌細胞的TLR4表達水平升高，釋放大量HMGB1物質，進而通過TLR4通過激活NF-κB，增強Hep-2喉癌細胞凋亡抵抗性，促使癌細胞增殖分化。本研究結果顯示，喉癌組織中的TLR4 mRNA表達水平較癌旁正常組織要高(P<0.05)，且其表達水平與癌組織分化程度呈負相關，與浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期呈正相關(P<0.05)，可能與TLR4與自身配體結合后產生的一系列級聯反應有關。TLR4可通過一系列信號轉導(如髓樣分化因子88依賴途徑和非依賴途徑)，上調抗原遞呈細胞，激活特異性免疫應答，幫助機體抵抗病原微生物的感染和修復損傷的組織，但是當TLR4傳導通路持續或異常活化可能會介導炎癥通路，引起炎癥反應，促使腫瘤免疫逃逸。Shyam等[13]的研究也發現，TLR4信號通路能夠刺激TNF-α等促炎物質大量分泌，進而參與到腫瘤新生血管形成，或促使癌細胞黏附、遷移，導致癌細胞侵襲、轉移，進一步說明了TLR4 mRNA可能參與喉癌的發生、發展。

本研究還發現喉癌組織的TCF21 mRNA表達較癌旁組織要低(P<0.05)，且其表達水平與癌組織分化程度呈正相關，與浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期呈負相關(P<0.05)。TCF21為近年新發現的抑癌基因中的一種，屬于bHLH家族成員之一，被證實可影響細胞增殖、分化等生理過程的轉錄調控因子[14]。Wei等[15]的研究發現約有80%以上的喉癌患者會出現TCF21甲基化或TCF21表達下調，也正式由于其表達下調致使細胞DNA修復基因的生理功能異常，難以及時修復損傷DNA結構，對細胞生長分化產生一定抑制作用，進而引起抑制細胞異常增殖的能力有所降低，誘發癌癥。另有研究[16-17]報道，過表達TCF21能夠通過對細胞周期、細胞凋亡相關因子的表達水平產生調控作用，進而阻止人喉癌細胞株Hep-2增殖分化，促進細胞凋亡，故TCF21可成為喉癌診斷或靶向治療的潛在作用位點。此外，本研究顯示癌組織的TLR4 mRNA表達水平與TCF21 mRNA表達呈負相關性(r=-0.454，P<0.001)，提示TCF21能夠負性調節喉癌組織TLR4表達，并可抑制細胞的侵襲、轉移能力，但其具體機制仍有待進一步深入研究。

綜上，TLR4高表達、TCF21低表達在喉癌發生發展過程中發揮著重要的作用，兩者具有一定的相關性，相互作用可能促進喉癌細胞惡性增殖分化，故檢測TLR4、TCF21表達水平有望成為喉癌患者病理特征判斷的主要生物學指標，為本病診療提供可靠的依據。