本源菌降解褐煤的生物學特性及微觀結構分析

牛 顯，牛 煜，索永錄

(1.西安科技大學 能源學院，陜西 西安 710054；2.內蒙古工業大學 礦業學院，內蒙古 呼和浩特 010051；3.山西大學 電力與建筑學院，山西 太原 030006)

0 引 言

褐煤占中國煤炭總儲量的13%以上，已探明可采儲量約1 300億t[1]。然而，環境污染大和應用價值低的現狀嚴重制約了褐煤產業的發展[2-3]。褐煤的微生物降解轉化技術以其環境友好、反應溫和、成本低廉、產物用途廣等優勢[4]，已成為當前研究熱點。

自20世紀80年代以來，德國FAKOUSSA和美國COHEN分別報道了真菌可以在煤上生長并將其轉化為黑色水溶物[5-6]。此后，大量學者集中于煤種、菌種、機理和產物等4個方面的研究。在煤種方面，SCOTT等指出煤種和煤樣的氧化預處理會影響真菌類對其的溶解性，氧化程度高的煤易被降解[7]；也有學者利用光-氧氧化、過氧化氫、硝酸、氫氧化鈉和紫外光照等氧化預處理方法，都不同程度的使煤炭的生物降(溶)解率得到了提高[8-12]。在菌種和機理方面，STRANDBERG等報道了外源放線菌能夠產生胞外堿性物質溶解煤炭，生成黑色液體，而且溶解度隨pH值的升高而增大[13]。QUIGLEY等評價了9種外源微生物對煤炭的降解情況，并發現胞外堿性產物是煤樣降解的原因[14]；RALPH等系統的研究了外源真菌黃孢原毛平革菌，證實了其分泌的氧化酶(木質素過氧化酶、錳過氧化酶、漆酶)能夠降解煤中部分大分子[15]；COHEN等研究外源擔子菌云芝的溶煤活性，發現產生草酸能夠螯合煤中多價金屬離子[16]；袁紅莉等發現了具有降解褐煤的外源斜臥青霉菌，并證實了分泌的酯酶對褐煤有解聚作用[17-18]。在產物方面，主要研究了產物組成、產物結構、溶解度、分子量、酸沉淀性質、吸光度、蛋白質含量、發熱量以及產物應用領域等[19-21]。

以上研究中學者們更多地關注于外源菌，忽略了外源菌很難適應原位復雜的煤層環境而存活，其高效的降解性無法實現的問題。以原位褐煤中篩選本源菌為切入點，研究了本源菌F.spp.NF01生長曲線、pH-t曲線和固液態降(溶)解褐煤的生理學特性，表征了菌株降解后殘煤的形貌、官能團、自由基，旨在補充原位煤層中本源菌降(溶)解褐煤方面的數據，為推進本源菌對褐煤降解特性研究發展起到積極作用。

1 材料與方法

1.1 煤樣

篩選本源菌株的褐煤煤樣采集于內蒙古自治區赤峰市元寶山煤田的6家煤礦西二采區北三段6-8工作面。先用滅菌取樣鏟鏟去工作面已裸露煤炭，然后利用滅菌取樣器(1 000 mm×25 mm)快速插入新揭露的煤壁取樣，裝入無菌袋密封，4 ℃保溫箱運輸，如圖1所示。其中，取樣器常被用做土壤和糧食取樣。

圖1 采樣工具

原煤樣采集于地面煤場不同方位的褐煤，用編織袋密封保存。利用顎式破碎機和密封式制樣粉碎機逐步粉碎，并用SDNS 200a標準振篩機篩分成粒徑200目(0.074 mm)顆粒。預處理煤樣是按1 g煤與10 mL 1 mol/L NaOH的比例混合，48 h后抽濾洗滌至中性，烘干，牛皮紙包好備用。

1.2 真菌的分離與鑒定方法

1.2.1 真菌的分離方法

基本培養基MM：3 g/L KH2PO4，1.5 g/L MgSO4·7H2O，1 g/L(NH)2SO4，0.1 mg/L FeSO4·7H2O，0.2 mg/L CuSO4·5H2O，0.68 mg/L ZnSO4，pH調至中性，配固體培養基加1.5% Agar。

G為10 g/L葡萄糖；M為10 g/L麥芽糖；SGC為10 g/L葡萄糖酸鈉。

在超凈工作臺中，將篩選本源菌的褐煤煤樣加入滅菌的100 mL MM-GM(基本培養基加入G和M的碳源)培養液中，28 ℃150 rpm，富集培養3 d。將富集菌液1 mL轉接到100 mL MM-GM培養液且加有1 g滅菌的原煤樣中，篩選7 d，再經多次富集培養和平板分離，得到一株真菌NF01，并用20%甘油-70 ℃保存。

1.2.2 真菌的鑒定方法

真菌NF01通過平板培養和掃描電鏡的形態學觀測，結合ITS測序，完成菌種的鑒定。其中，掃描電鏡樣品的制備如下

1)滅菌蓋玻片45°插入固體培養基，讓菌株爬片生長；

2)取長有菌絲的蓋玻片，2.5%戊二醛4 ℃固定48 h；

3)磷酸緩沖液(pBS)漂洗3次，以30%，50%，70%，80%，90%，100%Ⅰ，100%Ⅱ濃度的乙醇梯度脫水，15 min/次；

4)75%叔丁醇，100%叔丁醇各15 min；置冰箱冷凍室固化，抽真空干燥，噴金觀察。

測序步驟如下

1)刮取培養7 d的平板上菌絲50 mg，液氮研磨后轉移至EP管中，利用試劑盒SK8259對真菌基因組DNA抽提；

2)凝膠電泳檢測抽提DNA是否成功；

4)取PCR擴增產物5 μL用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，判斷擴增是否成功；

5)將菌株ITS序列通過NCBI數據庫的BLAST進行同源性序列比對，得到相關的同源性菌株信息。

1.3 真菌NF01的特性分析

1.3.1 真菌NF01的生長曲線

在超凈工作臺中，將1 mL真菌NF01的菌液量分別轉接到24瓶裝有滅菌的100 mL MM-SGC培養液燒瓶中，28 ℃150 rpm搖床培育8 d。每24 h，取出3個燒瓶，離心，洗滌，收集菌絲，烘干，稱取菌絲干重。

1.3.2 真菌NF01生長液的pH值

或“言必稱西”，“呲必中國”；或講社會主義制度則“完美無缺”，講資本主義制度則“一無是處”，不是運用馬克思主義的唯物辯證法分析問題。

在超凈工作臺中，將1 mL真菌NF01的菌液量分別轉接到3瓶MM-SGC(100 mL)培養液中，28 ℃150 rpm搖床培養8 d。空白組MM-SGC(100 mL/瓶，共3瓶)為不接真菌。每天分別取3 mL菌液，離心，吸取上清液置于試管，用賽多利斯PB-10檢測儀測pH值。

1.3.3 真菌NF01降(溶)解褐煤

在超凈工作臺中，將真菌NF01接種到MM-SGC固體培養基上，28 ℃恒溫避光培養3 d。3 d后，將滅菌的原煤樣(0.5±0.000 5 g，200目)和預處理煤樣(0.5±0.000 5 g，200目)置于固體培養基菌絲上，觀察褐煤的溶解情況。

1.3.4 真菌NF01的褐煤降(溶)解率

配置100 mL MM-SGC培養液18瓶，9瓶/組，共2組。第1組接種1 mL真菌NF01的菌液和添加預處理褐煤，第2組不接種菌液僅添加預處理褐煤，28 ℃150 rpm搖床培育。每組在第3天、第5天、第7天分別取出3瓶，測pH值，離心，多次洗滌，收集褐煤，烘干，稱取干重，利用如下公式計算褐煤降(溶)解率。

式中Lbr為褐煤生物降(溶)解率，%；M0為降(溶)解前褐煤質量，m；m1為降(溶)解后的褐煤質量，m。

1.4 真菌NF01降解褐煤的表征

配置100 mL MM-SGC培養液6瓶，3瓶/組，共2組。第1組中分別接種真菌NF01且加入1.0±0.000 5 g滅菌的預處理褐煤，記“Ⅰ-殘煤”代表；第2組中不接種真菌NF01，但分別加入1.0±0.000 5 g滅菌的預處理褐煤，記“Ⅱ-殘煤”代表。在28 ℃150 rpm搖床中，培養7 d，離心，洗滌3次，收集殘煤，烘干備測。

1.4.1 褐煤的形貌

用掃描電鏡JSM-7900F對原煤樣、Ⅰ-殘煤和Ⅱ-殘煤進行測試，分析煤樣降解前后形貌變化特征。樣品先干燥30 min，然后用導電膠粘附樣品在檢測臺上，噴金10 s，放大10倍-500 000倍，加速電壓0.01～30 kV。

1.4.2 褐煤的紅外光譜

利用紅外光譜Nicolet iS50對原煤樣、Ⅰ-殘煤和Ⅱ-殘煤煤樣官能團進行測定分析。先將測試樣品和溴化鉀真空干燥，分別取煤樣各1 mg與100 mg純KBr研細混合，研磨到粒度小于2 μm，HY-12型粉末壓片機壓成透明薄片。光譜儀分辨率4 cm-1，掃描32次，測定范圍4 000～400 cm-1。

1.4.3 褐煤的自由基

用電子順磁共振EMXPLUS10/12對原煤樣、Ⅰ-殘煤和Ⅱ-殘煤煤樣進行自由基測定，分析自由基濃度Ng、朗德因子g值和線寬ΔH參數。微波頻率分別為9 839，9 837和9 843 MHz，微波功率0.2 mW，中心磁場351 mT，掃描寬度10 mT，調制頻率100 kHz，調制振幅0.1 mT，時間常數0.01 ms，掃描60 s。

2 結果與討論

2.1 真菌鑒定

從圖2可以看出，真菌NF01培養3 d后，菌落直徑2.5～3.1 cm，氣生菌絲為白色絮狀、無隔透明、質密突起。小型分生孢子為單生，無隔，數量多，形態多為卵形、橢圓形，大小2.67-7.55×0.89-1.83 μm；大型分生孢子散生于氣生菌絲上，數量少，無隔，形狀多為長筒形，大小8.33-12.5×1.66-2.5 μm；產孢細胞類型為簡單瓶梗。

圖2 真菌NF01的形態學特征

真菌NF01測定的ITS序列519 bq已錄入NCBI GenBank數據庫，登錄號MN822700。通過BLAST進行相似性比對，發現Fusariumproliferatum(MK226301.1，MK226291.1，MK020694.1)、Fusariumsp(MK250069.1，MH050788.1，MH511574.1)、Fusariumfujikuroi(MK166052.1，MH911404.1，MH282573.1)和Fusariumverticillioides(MF882928.1)相似度均為100%，鑒定屬于鐮刀菌屬。

根據菌株形態學特征，檢索《真菌鑒定手冊》《中國大型真菌》中描述各種真菌的形態，結合測序鑒定結果，菌株NF01屬于鐮刀菌屬(FusariumsppNF01)。鐮刀菌環境適應能力很強，嚴寒的北極和炎熱的沙漠中都有發現，并且據已有研究，其具有降(溶)解褐煤[22]和去除揮發性有機化合物及多環芳烴的能力[23]。在原位煤層中發現鐮刀菌，說明其具備適應原位復雜煤層環境的優勢，為褐煤的本源菌降解研究起到重要意義。

2.2 F.spp.NF01生長曲線、pH-t曲線及降(溶)解褐煤實驗

從圖3可以看出，在生長曲線中，前3天的真菌F.spp.NF01生長為對數生長期，第3天的菌體干重達到了0.142 g峰值，從第4天開始，菌株生長進入相對平穩期。在pH-t曲線(有菌)中，隨著真菌F.spp.NF01生長，pH值逐漸增大，菌液呈現出堿性。第3天菌液pH值相對于最初pH值，增長率達到了25.1%，從第4天開始，pH值增幅相對平緩，最大pH值為第7天的9.28；而pH-t曲線(無菌)的空白組，pH均值為6.92，變化不大，菌液仍顯中性。這說明生長于MM-SGC培養液的真菌F.spp.NF01能夠分泌堿性物質，使菌液呈現出堿性環境。

圖3 F.spp.NF01的生長曲線和pH曲線

從圖4可知，煤粉在放置菌絲上培養3 d后，左側預處理煤粉出現了黑色液滴，0.5 g煤粉完全被降(溶)解，而右側原煤粉沒發現黑色液滴，未被降(溶)解。這說明6家煤礦褐煤可以通過預處理實現F.spp.NF01菌絲的降(溶)解，預處理破壞了褐煤結構使菌株更容易降(溶)解褐煤。

圖4 F.spp.NF01降(溶)解褐煤

從表1可知，第1組中，第3天含煤菌液的pH值7.2增至7.87，褐煤的降(溶)解率是7.46%，第5天，隨著pH值逐漸增大，褐煤降(溶)解率也逐漸增大，達到18.14%，第7天，pH值達到9.41，較最初pH值7.2，增幅30.7%，降(溶)解率也增至27.9%。第2組中，pH值沒有變化，呈現中性，褐煤只有少量減少。相對于無煤的生長液pH值，有煤菌液前3天pH值增幅不大，但第7天pH值則有較高增幅。說明在菌株生長前期，褐煤的存在對菌液pH值增加有抑制，生長后期，有促進作用。

表1 褐煤的降(溶)解率及pH值

經數據分析發現，真菌F.spp.NF01生長在含褐煤的MM-SGC培養液中能夠使菌液呈現堿性環境，伴隨著菌液pH值的升高，褐煤降(溶)解率也逐漸增大，褐煤降(溶)解率與菌液pH值存在正相關性。堿性的生長液使褐煤表面的酸性基團離子化，如褐煤中含有可溶于堿液內的腐殖酸[13-14]，從而改變褐煤的親水性，提高降(溶)解率。因此，菌株產生的堿性物質參與了褐煤的降(溶)解。

2.3 褐煤的表面形貌

從圖5(a)和圖5(b)可知，原煤樣表面形貌相對平整，經無菌培養液搖床7 d后的NaOH預處理煤樣(Ⅱ-殘煤)表面離散顆粒增多，且變得起伏粗糙。而有菌株作用的煤樣(Ⅰ-殘煤)表面顆粒變得更小，起伏更大，且出現了較多的裂隙結構，如圖5(c)所示。這說明相對于原煤樣和無菌株作用的預處理煤樣，有菌株作用的預處理煤樣表面形貌變化更大，煤樣表面形貌的改變與真菌F.spp.NF01的參與有關。

圖5 褐煤的形貌

2.4 褐煤的紅外光譜

從圖6可以看出，虛垂線標記的11處原煤樣、Ⅰ-殘煤和Ⅱ-殘煤煤樣紅外光譜的吸收峰強度和峰形有明顯的差異。褐煤官能團的紅外吸收峰頻率特征，見表2。

表2 褐煤官能團的紅外吸收峰頻率特征

圖6 褐煤的紅外光譜

2.5 褐煤的自由基

從圖7(a)和圖7(b)所知，Ⅱ-殘煤、原煤樣和Ⅰ-殘煤的EPR波譜對稱性峰和自由基濃度依次增大。相比于原煤樣，Ⅱ-殘煤自由基濃度減少，說明預處理過程中自由基活性位點逐漸減少。在紅外光譜中，Ⅱ-殘煤羥基官能團的增多，可能與自由基位點被含氧官能團消耗有關。而對于原煤樣和Ⅱ-殘煤，菌株作用后的Ⅰ-殘煤，自由基濃度增大，說明菌株作用過程中發生了褐煤結構的改變，使其結構中的弱鍵斷裂并張開，以及芳香族結構單元間橋鍵和側鏈的斷裂，使小分子自由基含量逐漸增加，自由基濃度升高。

從圖7(c)可以看出，相比于原煤樣，Ⅱ-殘煤朗德因子g值增大可能與煤中含有的自由基種類、雜原子等有關。而對于原煤樣和Ⅱ-殘煤，Ⅰ-殘煤自由基g值的增大可能是產生較多小分子自由基中的雜質成分有關，如氮、硫和一些金屬自由基。因為g值是表征分子內部結構特征的量，代表著不同的自由基種類。已有研究可知，碳原子為中心的自由基g值較小，過氧化、含硫類及金屬離子絡合物自由基g值偏大[30-31]。PETRAKIS研究了自由基g值，并總結出含氮自由基g為2.003 1，含硫自由基g為2.008 0～2.008 1，這些雜原子自由基對g值有影響[32]。這與高階煤(無煙煤)含雜原子少，g值偏小的結果相一致。

從圖7(d)可知，Ⅰ-殘煤煤樣譜線寬明顯偏大，相對于Ⅱ-殘煤和原煤樣。這說明該菌株作用褐煤過程中，形成了大量小分子自由基，電子自旋減弱，弛豫時間縮短，導致譜線寬度逐漸增大。

圖7 褐煤的自由基

3 結 論

1)原位煤層中分離得到一株真菌，通過形態學特征和ITS測序鑒定，菌株為鐮刀菌屬。菌株F.spp.NF01分離與鑒定進一步豐富了降解褐煤的本源菌庫，為褐煤的生物降解研究提供了有價值的菌屬信息。

2)F.spp.NF01生長于MM-SGC培養液中呈現堿性，pH值最高達9.41，生長6 d的菌絲可完全降(溶)解0.5 g預處理褐煤，且預處理褐煤的降(溶)解率，隨著含煤菌液pH值的升高而增大。菌株產生的堿性物質參與了褐煤的降(溶)解。分析得到的生物學特征結果是剖析堿作用機理的重要數據，將為揭示堿作用機理研究起到積極作用。

3)褐煤的表征說明了F.spp.NF01可以降解預處理褐煤，使其表面形貌、官能團和自由基發生改變。在形貌上，表面變得更加粗糙，結構增多。在官能團上，芳環側鏈基團、醚鍵、碳碳雙鍵、脂肪族甲基和亞甲基等官能團吸收峰強度減弱。在自由基上，自由基濃度、朗德因子g值和線寬ΔH增大。殘煤微觀結構表征豐富了褐煤生物降解產物的研究，推進了降解產物的增值研究工作。