高壓液相色譜-熒光檢測法檢測蜂王漿中喹諾酮類藥物殘留的方法

王圣義，胡 娟

（1.武漢市華測檢測技術有限公司，湖北 武漢 430070；2.湖北省揚子江蜂業有限公司，湖北 武漢 430070）

諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星均屬氟喹諾酮類，為喹諾酮類第三代藥物，屬于廣譜抗菌藥[1-3]。在養蜂生產過程中，蜂農為了預防和治療蜂病，有時要用到藥物，而藥物的來源很混雜，有人用藥和獸用藥，還有的蜂農使用了一種含有喹諾酮類藥物成分卻沒有進行標簽標識的藥物，這樣就可能導致生產的蜂王漿中有喹諾酮類藥物殘留。

國內外檢測喹諾酮藥物殘留的方法有很多，主要有微生物法[4-6]、酶聯免疫法[7-9]、高壓液相色譜法[10-13]、液相串聯質譜法[14-16]、毛細管電泳法[17-18]等。目前在蜂產品行業，特別是蜂王漿生產企業，大多以酶聯免疫方法作為蜂王漿獸藥殘留監控的主要手段。酶聯免疫方法具備快速簡便、靈敏度高、特異性強、對設備要求不高以及檢測成本低等特點，但酶聯免疫法不能將每種喹諾酮類藥物單獨檢驗而準確定量。高壓液相色譜儀在一定程度上可以實現對不同喹諾酮藥物的分離而進行單個定量，這對于蜂王漿生產企業而言有重要的意義。因此，對蜂王漿中喹諾酮類藥物殘留量的檢測方法進行研究，對于豐富獸藥殘留的檢測方法以及增強企業自檢自控能力非常有意義。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

DIONEX U3000 高壓液相色譜儀配RF2000 熒光檢測器（美國戴安公司），SHZ-82A 水浴恒溫振蕩器(金壇區金南儀器廠)，PHS-3G 高精度pH 計(上海利達儀器廠)，TGL-16C 臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），固相萃取裝置（安捷倫科技有限公司）。

乙腈（ACN）、甲醇、甲酸均為色譜純，檸檬酸、乙酸銨、乙酸乙酯、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鉀、三乙胺均為分析純，三氟乙酸（TFA） 為化學純；檸檬酸-乙酸銨混合鹽溶液：分別精確稱取10.507 0 g 檸檬酸、0.770 8 g 乙酸銨，用重蒸餾水溶解并稀釋定容至1 000 mL，用三乙胺調節pH 為3.0；諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星標準品（德國Dr.Ehrensorfer 公司）

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

準確稱取試樣2 g，精確至0.01 g，置于100 mL塑料瓶中，加入0.2 mol/L 的三氟乙酸溶液10 mL，于漩渦混合器上將樣品分散，然后加入10 mL 乙腈，于康氏振蕩器上振蕩20 min，然后轉移至50 mL 的塑料離心管中，以4 000 rpm 離心8 min，然后將上清液轉移至100 mL 的茄型瓶中，再向沉淀中加入10 mL的0.2 mol/L 的三氟乙酸溶液，于漩渦混合器上將沉淀分散，然后轉移至100 mL塑料瓶中，再加入10 mL 乙腈，于康氏振蕩器上振蕩10 min，再以4 000 rpm /min離心8 min，合并兩次的上清液，將上清液于50℃旋轉蒸發除去乙腈，然后將經過濃縮的樣液于15 000 rpm/min 離心5 min。上清液備用。

將SCX 固相萃取小柱安裝在固相萃取裝置上，分別先后用1 柱管甲醇和1 柱管水活化柱子。然后將樣品處理得到的上清液轉移至SCX 柱上，通過調節真空度讓樣液以4 秒1 滴的速度通過柱子。待樣液全部通過柱子后（注意保持柱體濕潤），先用2 柱管水以2～3 秒1滴的速度淋洗柱子，再用1 柱管甲醇和1 柱管水以同樣速度淋洗柱子。最后用4 mL 0.1mol/L氫氧化鈉溶液洗脫柱子，收集洗脫液。向洗脫液中添加200 μL 15%的 檸檬酸，混勻，用0.45 μm 的濾膜過濾，待測。

1.2.2 標準溶液的配制

用十萬分之一電子天平稱取諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星標準品約0.003 00～0.005 00 g 到10 mL容量瓶中，加入0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液2 mL和甲醇5 mL，超聲使之溶解，靜置，用甲醇定容。然后各移取適量溶液至另一容量瓶中，制成濃度為100 μg/mL 貯備液，存放于4℃冰箱中。

移取標準貯備液0.5 mL，用甲醇稀釋并定容于50 mL容量瓶中，制成濃度為1 μg/mL的標準工作液。使用時用流動相稀釋標準工作液至所需濃度。

(3)規劃水平年(2020年、2030年)灌溉保證率50%相比75%，水資源承載能力評分較高，說明可以采用降低保證率灌溉更多耕地的方法以達到總產值的增加，提高山塘水資源的承載能力。

1.2.3 儀器條件

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱及檢測器、檢測波長的選擇

喹諾酮類物質屬于酸堿兩性物質，其結構中的叔胺基和羥基官能團能在水中發生解離，色譜柱固定相表面殘存的硅醇基和金屬離子可以通過氫鍵或離子交換作用強烈吸附喹諾酮類化合物而出現峰形變寬、拖尾以及保留時間不穩定或過長，甚至被保留在色譜柱上，導致峰形異常和分離度下降[19]。因此需選用高純硅膠為基質并經過封端處理的C18 等反相色譜柱作為分離柱。實驗在所使用的幾款色譜中，發現美國戴安公司生產的ACCLAIMTM120 C18 柱（5 μm，120 ，4.6 mm（id） ×250 mm） 能將3 種氟喹諾酮類藥物很好分離，并且峰形對稱而且尖銳，該色譜柱耐高壓且能長期使用，完全符合試驗要求。

喹諾酮類藥物本身具有較強的熒光吸收，無需進行衍生化就能直接進行分析，而且檢測靈敏度高，因此實驗選用熒光檢測器。通過熒光波長掃描，以及參考他人研究方法[20]，選擇RF2000 型熒光檢測器，激發波長280 nm，發生波長450 nm，可調節靈敏度和電信號增益，本次實驗采用的模式為“gain：4，sensitivity：high”。

2.1.2 流動相的選擇

喹諾酮類藥物具有可質子化的氮原子和離解的羥基，采用反相色譜柱測定此類藥物時，會出現峰的拖尾現象，必須在流動相中加入離子對試劑。離子對試劑包括磷酸鹽緩沖鹽溶液（三乙胺調節pH 值） -乙腈、四丁基溴化銨溶液- 乙腈、乙腈-（檸檬酸、醋酸銨混合溶液） 等。

比較了乙腈-（檸檬酸、醋酸銨混合溶液） 以及0.01 mol/L 四丁基溴化銨溶液（75%磷酸調節pH 為3） - 乙腈。發現采用乙腈-（檸檬酸、醋酸銨混合溶液） 作為流動相時，不能將諾氟沙星和氧氟沙星分開，而采用0.01 mol/L 四丁基溴化銨溶液（75%磷酸調節pH 為3） - 乙腈可以將諾氟沙星和氧氟沙星分開，但是氧氟沙星的檢出限偏低，考慮到研究的目的，最終選擇了乙腈-（檸檬酸、醋酸銨混合溶液） 作為流動相。結合使用戴安 公 司 的ACCLAIMTM120 C18 柱（5 μm，120 ，4.6 mm（id） ×250 mm），得到了較好的分離效果以及峰形，見圖4。

圖4 標準品色譜圖Fig.4 HPLC Chromat ogram of Mixed St andard QNs

2.2 樣品前處理條件的優化

2.2.1 樣品提取條件的優化

由于蜂王漿中成分復雜，含有大量的蛋白質、脂肪、糖類等物質，而不能通過采用簡單的稀釋處理而直接進樣分析。周萍等[21]研究了通過液液提取凈化的方法，由于受凈化方法的影響，通過凈化后的試樣氟喹諾酮類藥物殘留有一定的損失，樣品回收率范圍在46.5%～55.9%，通過采用基質標樣以及添加內標的方法對結果進行了校正。Lambardo-Aguei M 等[22]在采用液相串聯質譜法檢測蜂王漿的QNs 時為降低基質的干擾，通過減少稱樣量的辦法以及應用到了固相萃取凈化方法。本研究沒有采用基質標樣，而是直接采用標準工作液進行分析。在樣品前處理方面，通過采用合適的提取試劑以及利用固相萃取技術和合適的洗脫方式對樣品進行了凈化。

實驗比較了乙酸-乙腈體系、三氟乙酸-乙腈體系、偏磷酸-乙腈體系分別作為提取劑的效果。結果發現，使用三個體系都可以將三種氟喹諾酮類藥物從蜂王漿中提取出來。而三氟乙酸-乙腈體系優于另外兩種提取體系。

在對三氟乙酸-乙腈體系進行研究時，比較了不同pH 值分別為1.07、3、4.2 的三氟乙酸水溶液與乙腈組成的提取效果與基質干擾物的去除效果，結果表明pH 為3 的提取液基質干擾物含量少，最終選擇pH 3.0、0.2 mol/L三氟乙酸和乙腈組成的提取液體系。三者的提取效果（5%氨水甲醇洗脫物） 見圖1。圖中顯示在RT 為8.5 、 9.5、13.0 min 時，均不同程度存在干擾。在RT=9.5 時，1#有強干擾物存在。

圖1 不同pH值三氟乙酸- 乙腈對空白樣品基質的提取效果比較Fig.1The comparison of ext ract ing effect s on t he mat rix of blank samples by TFA- ACN at different pH value

2.2.2 提取液凈化方法的選擇

通過比較C18 固相萃取小柱、AX 固相萃取小柱以及SCX 小柱對樣品的凈化效果發現：如果按小柱所提供的說明書操作，一般得到的色譜圖中含有大量的基質干擾，見圖2。后來通過對SCX 柱的凈化方法進行探索，發現采用5%的氨水甲醇對SCX 小柱進行洗脫，只能洗脫目標物的30%～50%，而且洗脫液在經氮氣吹干后的復溶液經過儀器檢測發現含有大量干擾物質，見圖2。為了能將目標物從SCX 小柱上完全洗脫下來，實驗研究了不同洗脫液的洗脫效果，結果發現使用4mL 0.1mol/L 的氫氧化鈉溶液可以洗脫90%的被吸附的氟喹諾酮類藥物。而采用200 μL 15%的檸檬酸調節洗脫液pH 值后，經過儀器進行分析發現在藥物色譜保留時間，空白樣品幾乎沒有基質干擾，見圖3。

圖2 三種固相萃取小柱對空白蜂王漿的凈化效果比較Fig.2 Comparison of clean- up effect s on blank royal j elly of t hree kinds of SPE columns

圖3 兩種針對SCX吸附空白蜂王漿基質洗脫效果的比較Fig.3 comparison of t wo elut ingeffect s on mat rix of blank royal j ellyabsorbed by SCX SPE column

2.3 標準曲線

按照標準曲線的繪制方法進行對標準樣品的測試，記錄色譜峰高。諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星在2～50 μg/kg 范圍內線性良好,當濃度達到100 μg/kg 時，在選定色譜條件下濃度信號值超出了儀器的測定范圍。以諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星的峰高對諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星濃度作回歸分析，線性回歸方程和相關系數見表1。空白蜂王漿樣品以及空白添加回收色譜見圖5、圖6。

圖6 空白蜂王漿色譜圖Fig.6 HPLC Chromat ogram of blank royal j elly

表1 3 種氟喹諾酮類藥物的線性回歸方程及相關系數Table 1 Linear regressive equat ions and correlat ion coefficient s for t hree FQNs

2.4 方法的回收率和精密度測試

檢出限是指能夠被檢測到的分析物的最小含量，它與所使用的方法和設備有關。本實驗研究所使用的RF2 000 型熒光檢測器可調節靈敏度和電信號增益。本次研究采用的模式為“gain：4，sensitivity：high”，在這種模式下，樣品基質的噪音也會被相應放大，但是卻得到了比較好的目標分析物信號。回收率實驗按照1 倍、2 倍和10 倍定量限三個濃度水平進行添加標準工作液。測得本實驗方法的檢測限為1μg/kg（S/N=3），定量限為3μg/kg（S/N≈10）。實驗過程中稱取空白蜂王漿2.0 g，分別添加3 種氟喹諾酮類藥物含量為6.0 ng、12.0 ng、60 ng 標準到蜂王漿中，漩渦混合1min，置于暗處放置30 min，然后按本方法進行樣品處理和檢測，精密度測試結果為三種氟喹諾酮藥物殘留含量在各個水平的RSD 值均低于20%。結果見表2，回收率和精密度均符合GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》標準對檢測方法確認的技術要求的規定。

表2 3 種氟喹諾酮類藥物殘留的加標回收率與相對標準偏差（n=5）Table 2 Spiked recoveries and relat ive st andard deviat ions of 3 QNs residues(n=5)

3 結論

本試驗研究了不同提取液、不同SPE 柱、不同洗脫液對測試結果的影響，最終建立了以三氟乙酸- 乙腈提取蜂王漿中的3 種氟喹諾酮藥物殘留，提取液經過濃縮后，經過SCX 固相萃取小柱進行樣品凈化，最后用4mL 0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液洗脫，再用15%檸檬酸調節pH 值，然后經過高壓液相色譜- 熒光檢測器檢測的方法。在該方法中，采用氫氧化鈉洗脫和用檸檬酸調節pH 值的試樣液可以最大限度地降低蜂王漿基質的影響。方法具有檢測限低、準確度高等特點，可以作為蜂王漿生產企業和檢測機構進行蜂王漿3 種氟喹諾酮的殘留檢測方法。