枇杷炭疽病病原菌鑒定及防治藥劑篩選

王文靜，甘 震，石緒根，宋水林，郭德康，陳麗林，況衛剛

（江西農業大學 農學院，江西 南昌 330045）

【研究意義】枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）隸屬于薔薇科（Rosaceae）、枇杷屬（Eriobotrya），其栽培歷史已超過2 000年，別名又叫蘆橘、蘆枝、金丸、炎果、焦子。其易于栽培種植，適應性較強，經濟效益高，果實不僅營養豐富、風味獨特，而且具有潤肺、抗炎、止咳平喘、健胃潤脾等功效，因而深受國內外消費者喜愛，從而成為了世界性精美果品之一[1]。枇杷在30多個國家和地區均有分布和栽培[2-3]，其中我國枇杷的栽培面積和總產量均居于世界首位。枇杷在浙江、福建、江西等地廣泛種植，其中安義枇杷是江西省特產，歷史悠久。由于具有較高的經濟價值，枇杷逐漸成為栽培區農村經濟發展的支柱產業之一。但是，枇杷從種植、采收到果實的貯存、運輸等整個過程中都會受到各種病害的危害。常見的有灰斑病、輪紋病、炭疽病、葉尖焦枯病、圓斑病等，這些病害會導致樹勢早衰、果實產量和品質下降，成為限制枇杷產業快速發展的主要因素[4]。【前人研究進展】國內外關于枇杷病害的研究很多，Perell等[5]從培養物及分生孢子形態特征、致病性測定等方面將阿根廷枇杷灰斑病致病菌鑒定為Pestalotiopsis guepinii。Chen等[6]從中國安徽省涇縣枇杷灰斑病病樣上分離到致病菌，通過形態學觀察和分子生物學技術將其鑒定為P. theae。Xiao等[7]研究結果表明安徽省黃山市枇杷灰斑病的病原為Pestalotiopsis microspora。日本的相關學者認為P. eriobotryfolia、P. funerea、P. adusta、P. eugeniae、P. longiaristata均可引起枇杷灰斑病[8]。研究學者對福建[9]、貴州[10]等地枇杷病害研究表明，病原菌Ascochyta eriobotryae可導致枇杷輪紋病。而對于枇杷炭疽病的病原，研究結果表明Colletotrichum acutatum和C. siamense均可導致枇杷炭疽病的發生[11]。炭疽菌屬種類多樣，存在多個復合種，如C. gloeosporioides復合種、C. acutatum復合種和C. magnum復合種等。這些炭疽菌形態特征不穩定，很難通過形態學進行鑒定[12]。ITS作為用于真菌鑒定的DNA條形碼，對很多真菌種類鑒定效果較好，但是很難將炭疽菌復合種區分開[13]。隨著分子生物學發展，不同的分子標記如ACT，TUB2，GPDH和ApMat (APN2/MAT-IGS)等用于炭疽菌的鑒定中，使得鑒定結果更為準確[14]。張丹華等[15]研究表明，不同地域枇杷病害的病原菌可能不一致。鑒于炭疽菌種類多樣，寄主范圍廣泛，我國枇杷種植分布又較廣，因而有必要對枇杷上的炭疽病菌種類進一步研究。【本研究切入點】近年來，枇杷炭疽病發生越來越重，但是對于引起江西枇杷炭疽病的病原尚缺乏研究。【擬解決的關鍵問題】本研究擬對對江西省宜春市枇杷炭疽病病原進行鑒定，進一步采用菌絲生長速率法分別測定了6種不同藥劑對枇杷炭疽病菌的室內毒力，以期為病害的綜合防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

枇杷炭疽病病葉采自江西省宜春市上高縣果園。

1.2 供試藥劑

30%苯甲·嘧菌酯懸浮劑（陜西標正作物科學有限公司）；75%戊唑?嘧菌酯水分散性粒劑（上海綠澤生物科技有限責任公司）；50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑（蘇州富美實植物保護劑有限公司）；75%肟菌?戊唑醇水分散性粒劑（拜爾股份公司）；400 g/L氟硅唑乳油（江門市大光明農化新會有限公司）；1%申嗦霉素懸浮劑（江蘇好收成韋恩農化股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1病原菌分離培養采用組織分離法對病原菌進行分離，在超凈工作臺內將刀片滅菌后切取病葉病斑交界處組織塊，每片葉片取1～2個。將病樣組織用體積分數為70%酒精浸泡30 s、0.1%的升汞浸泡2min、無菌水沖洗3次，將消毒后的病樣組織置于滅菌的濾紙上晾干，置于PDA培養基上，在24 ℃恒溫培養箱中進行培養。每天觀察，待病樣組織中長出菌絲后及時純化，保存4 ℃備用。

1.3.2病原菌鑒定將經過純化處理的病原菌進一步培養，等菌絲長出后，拍照記錄菌落正反面形態。同時制作臨時玻片，在顯微鏡下察看其分生孢子形態特征，并測量其大小。

將純化后的真菌在PDA培養基上培養7 d后，采用生工生物真菌DNA提取試劑盒（貨號B518259）提取其基因組。選取炭疽菌ApMat引物CgDL_F6（5'-AGTGGAGGTGCGGGACGTT-3'）和CgMAT1_F2（5'-TGATGTATCCCGACTACCG-3'）[16]對真菌的ApMat區域進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL：基因組DNA 2 μL，CgDL_F6 1 μL，CgMAT1 F2 1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。

PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；最后72 ℃延伸10 min。用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物之后，將PCR產物送到生工生物工程（上海）有限公司進行序列測定。將測序獲得的結果提交至NCBI數據庫中進行BLAST比對，得到鑒定結果。

1.3.3室內毒力測定本研究選取生產上常用的防治炭疽病菌的藥劑，苯甲·嘧菌酯、戊唑·嘧菌酯、咪鮮胺錳鹽、肟菌·戊唑醇、氟硅唑、申嗦霉素，進行各藥劑室內毒力測定。用菌絲生長速率法測定不同殺菌劑對枇杷炭疽病病原菌菌絲生長的影響。將藥劑推薦的使用濃度作為初始濃度，用無菌水將各殺菌劑10倍梯度稀釋，配置成6個不同溶度的母液。用移液器吸取2 mL的不同濃度的供試藥劑母液，分別加入到18 mL滅菌的PDA培養基，充分混勻后倒入培養皿中，配制成不同濃度的含藥培養基。用無菌打孔器在枇杷炭疽病菌菌落邊緣處打孔取5 mm的菌餅，接種在含藥PDA平板的中央，以未加入藥劑的PDA培養基為對照，每個處理重復3次。接種后置于24 ℃恒溫箱中倒置培養，待對照組菌餅長至整個培養皿的2/3時，用十字交叉法測量供試菌株在不同濃度藥劑平板上的菌落直徑，按照下列公式計算供試藥劑在不同藥劑濃度下的菌絲生長抑制率。

利用SPSS軟件求出抑制率機率值（y）與濃度對數（x）之間的毒力回歸方程、抑制中濃度EC50值及相關系數（r）。

2 結果與分析

2.1 枇杷炭疽病癥狀

炭疽病在枇杷整個生長期都可以發生，主要危害葉片和果實，在果實儲藏運輸期間也可發生。本研究通過田間對葉片癥狀進行了觀察，葉片受害初期病斑呈褐色，圓形或近圓形，后期病斑邊緣呈現暗褐色，中央變為灰白色，田間受害癥狀如圖1。

圖1 枇杷炭疽病葉片發病癥狀

2.2 病原菌鑒定

對分離到的真菌進行觀察，發現其菌落呈現灰白色，隨后顏色逐漸加深，在PDA培養基上于25 ℃、黑暗環境條件下培養7 d后，菌絲長滿整個培養皿，后期菌落上出現桔紅色的分生孢子團（圖2）。顯微鏡觀察到該菌分生孢子單胞、卵圓形、透明，兩端鈍圓，大小為（13.6～16.5）μm×（5.8～7.1）μm。通過查詢相關文獻，認為該真菌形態特征與果生炭疽菌一致[17]。

圖2 枇杷炭疽病菌菌落特征和分生孢子形態

對所獲得的菌株進行PCR擴增，結果如圖3所示，所得的電泳條帶明亮且單一，與Marker 2000比較，擴增獲得的片段大小約在750～1 000 bp（圖3）。利用CgDL_F6和CgMAT1_F2引物對PCR產物進行雙向測序，經NCBI比對，結果顯示其序列與果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola）的相似性和一致性均為100%。

圖3 供試菌株PCR擴增產物電泳結果

2.3 幾種殺菌劑對枇杷炭疽病菌的室內毒力比較

由表1可見，6種殺菌劑對枇杷炭疽病菌均表現出一定的抑制效果，但對菌絲生長的抑制效果不同，毒力差異較大。從藥劑的EC50來看1%申嗦霉素SC抑菌效果最強，其EC50為0.014 mg/L；其次是30%苯甲·嘧菌酯SC、50%咪鮮胺錳鹽WP和400 g/L氟硅唑EC，也表現出較好的抑制效果，EC50分別為0.020，0.021，0.026 mg/L；而75%戊唑·嘧菌酯WDG和75%肟菌·戊唑醇WDG表現出的抑菌活性一般，其EC50分別為0.560 mg/L和0.405 mg/L。

表1 6種殺菌劑對枇杷炭疽病菌的毒力

3 討論與結論

炭疽菌屬（Colletotrichum）真菌可以危害200多種植物，是重要的植物病原真菌。該真菌在自然界分布普遍，國內外有關炭疽病菌危害的報道屢見不鮮。由炭疽菌屬引起的枇杷炭疽病危害嚴重，制約枇杷產業鏈的健康發展。研究表明引起枇杷炭疽病的病原菌種類多樣，Cao等[18]研究表明Colletotrichum acutatum能夠引起枇杷采后果實炭疽病，李小霞等[19]基于ITS序列分析，認為引起貴州枇杷炭疽病的病原為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），Wu等[20]基于多基因序列分析結果表明，成都枇杷果實炭疽病病原為C. nymphaeae。本研究通過對江西省宜春市上高縣枇杷炭疽病進行調查取樣，基于ApMat基因序列分析，結果表明病原菌為果生炭疽菌（C. fructicola）。

為了篩選合適的藥劑用于田間枇杷炭疽病菌的防治，本研究利用生產上常用的6種殺菌劑對分離獲得的枇杷炭疽病菌進行室內毒力測定。結果表明，6種殺菌劑對病原菌的生長均有一定程度的抑制效果。1%申嗦霉素抑菌效果最好，其次為30%苯甲·嘧菌酯、50%咪鮮胺錳鹽、400 g/L氟硅唑。申嗪霉素是由熒光假單胞菌M18分泌的一種抗菌素，同時具有廣譜抑制植物病原菌并促進植物生長作用的雙重功能的殺菌劑，具有廣譜、高效的特點，對多種病原真菌、細菌具有較好的抑制效果，尤其是在跟其它藥劑配比時表現出良好的增效作用[21]。苯甲·嘧菌酯、咪鮮胺錳鹽和氟硅唑是生產上用于防治炭疽病較好的藥劑，具有很好的應用潛力。后續需要進一步對這幾種藥劑的田間效果進行試驗，同時在田間生產使用過程中進行藥劑輪換使用，以避免產生抗藥性。