雷竹內(nèi)生真菌分離及其功能性菌株篩選與鑒定

楊 瀅，樓玫娟，李子林，陳 靜，吳 斐，黃曉宇，郭春蘭，張林平*

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 鄱陽湖流域森林生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與修復(fù)國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江西 南昌 330045；2. 江西省資溪縣森林病蟲害防治檢疫站, 江西 資溪 335300；3. 九連山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，江西 龍南 341702）

【研究意義】雷竹（Phyllostachys praecoxf.prevelnalis）屬禾本科，是我國(guó)特有的優(yōu)良筍用竹[1]。但是，隨著種植面積的不斷擴(kuò)大，連年的覆被和不科學(xué)的施肥導(dǎo)致雷竹種植區(qū)大面積的竹林林地土壤退化越來越嚴(yán)重[2]。植物內(nèi)生菌是指對(duì)植物來說不會(huì)造成明顯病害，且在其整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段的某一階段生活在植物組織內(nèi)的一類微生物，主要包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生放線菌[3]。【前人研究進(jìn)展】近年來，植物內(nèi)生菌作為潛在的外源基因載體和生防資源，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用[4]。內(nèi)生真菌與寄主植物互惠共生，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物[5]，其主要活性成分有抗腫瘤活性[6-7]、抑菌活性[8-9]、抗氧化活性[10-12]和抗病毒活性[13-15]等。從禾本科植物分離得到的內(nèi)生真菌種類繁多，一般情況下，所屬地區(qū)不同，內(nèi)生真菌的種類也不同，具有較為明顯的差異，植物不同部位之間多樣性差異也較為明顯[16-17]。同時(shí)，大量研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌與禾本科宿主植物之間的互作有助于宿主植物抵抗病原菌，提高適應(yīng)生存環(huán)境的能力[18-19]。【本研究切入點(diǎn)】本研究以植物內(nèi)生菌為切入點(diǎn)，明確雷竹內(nèi)生真菌資源，探究?jī)?nèi)生真菌的功能性。【擬解決的關(guān)鍵問題】雷竹集約化經(jīng)營(yíng)過程中存在有機(jī)覆蓋物難降解、土壤退化嚴(yán)重、雷竹病害區(qū)域發(fā)生嚴(yán)重等問題，探究雷竹根系中是否存在多功能性內(nèi)生真菌，并通過微生物途徑解決上述關(guān)鍵問題。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1樣品及供試病原菌雷竹根部樣品于2019年7月采自江西省林業(yè)科學(xué)院竹子園；油茶炭疽病菌（Colletotrichum camelliae）、獼猴桃果腐病菌（Neofabraea actinidiae）、毛竹枯梢病菌（Ceratosphaeria phyllostachydis）等供試病原菌均由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2培養(yǎng)基纖維素剛果紅培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基等配方參考張喜慶等[20]。

1.2 研究方法

1.2.1雷竹根部?jī)?nèi)生真菌的分離將采集的雷竹根部樣品用自來水清洗干凈以除去根表面泥沙等雜質(zhì)，用無菌水清洗3遍，然后用過濾紙吸干表面水分，過濾紙使用前進(jìn)行高壓滅菌。根部?jī)?nèi)生真菌的分離具體參考王盈桐等[21]，內(nèi)生真菌純化后再轉(zhuǎn)接到PDA斜面4 ℃保藏備用。

1.2.2雷竹功能內(nèi)生真菌篩選重金屬耐受性菌株篩選操作方法參考曾松榮等[22]；病原菌抑菌活性內(nèi)生真菌篩選參考陳迪等[23]；纖維素降解內(nèi)生真菌篩選參考景如賢等[24]。

鉛耐受指數(shù)（TI）計(jì)算公式：

TI≥50%，則表示內(nèi)生真菌對(duì)Pb2+具有耐受能力，反之則表示對(duì)Pb2+不具備耐受能力。

1.2.3功能性內(nèi)生真菌鑒定采用形態(tài)學(xué)及 ITS 序列比對(duì)進(jìn)行鑒定[25]，將測(cè)定的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比較分析，用MEGA5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的分離

利用組織塊分離法，從雷竹根部共分離得到35株內(nèi)生真菌，表明雷竹根系內(nèi)生真菌資源較為豐富，部分分離純化的內(nèi)生真菌見圖1。

圖1 部分分離純化的內(nèi)生真菌

2.2 內(nèi)生真菌功能性篩選

2.2.1重金屬耐受性菌株篩選由表1可知，從雷竹根部中共篩選出具有重金屬耐受性的菌株有11株。其中菌株LZ022、菌株LZ033、菌株LZ020、菌株LZ034、菌株LZ035的TI值均高于100%；菌株LZ023、菌株LZ031、菌株LZ014、菌株LZ026、菌株LZ016、菌株LZ015的TI值均在60%～100%，表明以上11株菌株對(duì)重金屬鉛具有較強(qiáng)的耐受能力。

表1 具有耐受性的內(nèi)生真菌在一定Pb2+濃度下的TI值

2.2.2病原菌抑制的平板篩選雷竹內(nèi)生真菌對(duì)3種病原菌的抑制結(jié)果見圖2。菌株LZ031和菌株LZ012對(duì)毛竹枯梢病原菌、獼猴桃果腐病原菌、油茶炭疽病原菌均有抑制作用；而菌株LZ022、菌株LZ004、菌株LZ005僅對(duì)油茶炭疽病原菌有抑制作用。

圖2 部分內(nèi)生真菌對(duì)3種病原菌的抑制效果

2.2.3具有纖維素降解功能的內(nèi)生真菌篩選對(duì)雷竹內(nèi)生真菌進(jìn)行纖維素剛果紅平板培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，共篩選出7株菌株具有明顯的透明圈。菌株LZ011、菌株LZ033和菌株LZ028的D/d比值均高于3.0；菌株LZ008和菌株LZ003的D/d比值均為2.0～3.0；菌株LZ031和菌株LZ012的D/d比值均在1.0～2.0。表明菌株LZ011、菌株LZ033和菌株LZ028具有較好的纖維素降解能力(表2)。

表2 部分纖維素降解菌株D/d值

綜上所述，菌株LZ031對(duì)油茶炭疽病原菌、毛竹枯梢病原菌、獼猴桃果腐病原菌均有抑制作用，對(duì)重金屬具有耐受性，且具有較強(qiáng)纖維素降解能力。菌株LZ033對(duì)重金屬耐受能力強(qiáng)，且具有較強(qiáng)纖維素降解能力。因此，菌株LZ031和菌株LZ033都是具有潛在應(yīng)用價(jià)值的功能菌。

2.3 內(nèi)生真菌鑒定

2.3.1形態(tài)鑒定由表3可知，菌株LZ031形態(tài)特征與腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）基本一致，初步鑒定菌株LZ031為腐皮鐮刀菌。菌株LZ033形態(tài)特征則與蘆竹節(jié)菱孢（Arthrinium arundinis）基本一致，故初步鑒定為蘆竹節(jié)菱孢菌株LZ031和菌株LZ033的顯微結(jié)構(gòu)見圖3。

圖3 菌株LZ031（A）和LZ033（B）的顯微結(jié)構(gòu)

表3 菌株LZ031和菌株LZ033形態(tài)特征

2.3.2分子鑒定將菌株所測(cè)的ITS序列與GenBank及EzTaxon近緣種序列進(jìn)行同源性比對(duì)，利用MEGA5.0采用Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖4可知，菌株LZ031與鐮刀菌屬具有較高的序列相似性，且與Fusarium solani（KJ019829）在同一分支聚集，親緣關(guān)系最近。菌株LZ033與節(jié)菱孢屬具有較高的序列相似性，且與Arthrinium arundinis的親緣關(guān)系最近。

圖4 基于ITS序列構(gòu)建的菌株LZ031系統(tǒng)發(fā)育樹

綜合菌株形態(tài)特征和ITS序列分析，將菌株LZ031鑒定為腐皮鐮刀菌（F. solani），菌株LZ033鑒定為蘆竹節(jié)菱孢（A. arundinis）。

3 結(jié)論與討論

本研究從雷竹根部分離篩選出11株對(duì)鉛具有耐受能力的內(nèi)生真菌，其中5株對(duì)鉛表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受能力，TI>100%，表明植物內(nèi)生真菌在抵抗重金屬污染方面具有重要的作用，這與前人研究結(jié)果一致[26-28]。此外，本研究篩選出5株內(nèi)生真菌對(duì)油茶炭疽病原菌有拮抗作用，2株對(duì)毛竹枯梢病原菌有拮抗作用，2株對(duì)獼猴桃果腐病原菌有拮抗作用，其中菌株LZ031對(duì)油茶炭疽病原菌、毛竹枯梢病原菌、獼猴桃果腐病原菌均有較為明顯的拮抗作用，這與紀(jì)麗蓮[29-30]在病原菌抑制研究上結(jié)果一致。本研究采用羧甲基纖維素鈉平板法和剛果紅染色法[20]篩選出7株在降解纖維素方面具有顯著效果的內(nèi)生真菌菌株，其中3株具有較強(qiáng)的降解纖維素的能力，這表明雷竹根部的內(nèi)生真菌在降解纖維素方面具有較為豐富的資源。

植物中的內(nèi)生真菌種類眾多，資源豐富，是一類未被大量研究且前景廣闊的微生物。本研究從重金屬耐受，病原菌抑制，纖維素降解3個(gè)方面對(duì)從雷竹根部分離出來的內(nèi)生真菌進(jìn)行功能性初步篩選，研究結(jié)果表明，雷竹根部具有較為豐富的功能菌株資源。而對(duì)于菌株生物學(xué)特性、降解性能等方面的研究還不夠深入和廣泛，后期應(yīng)結(jié)合定量實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步的補(bǔ)充和完善。