香菇柄多糖的提取純化及抗氧化活性研究

陳 平 江崇弘

（1、南陽理工學院生物與化學工程學院，河南 南陽473000 2、河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室，河南 南陽 473000）

香菇為真菌植物門真菌香蕈的子實體，屬擔子菌綱傘菌科，是世界上著名的食用菌之一，且具有較高的藥用價值[1]。香菇多糖為香菇提取物中最重要的活性成分之一，在調控機體免疫，抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化等方面的作用顯著[2-4]，相關研究受到越來越多人的關注。有研究指出香菇多糖的分子量和純度與其功能密切相關。香菇多糖本身為一種復雜的生物大分子，大大增加了其提取純化的難度，進而限制了香菇多糖功效的發揮、構效關系以及作用機制的研究。目前用于香菇多糖提取的方法主要有熱水浸提、酸提法、酶提法、微波輔助法、超聲輔助法等[5]，這些方法所得多糖多為粗多糖。香菇柄是香菇采收過程中的副產物，產量大，價格便宜，主要用于加工生產香菇醬、飼料等低附加值產品，鑒于香菇柄中的營養成分近似于香菇傘，且多糖亦為其主要活性成分，故對香菇柄進行深加工和綜合利用具有重要的現實意義[6]。本文以香菇柄為原料，利用水溶液浸提法提取香菇柄中的多糖后，聯合柱層析法對提取的粗多糖進純化，并就純化所得多糖的抗氧化活性進行初步研究，以期為香菇柄中多糖的開發利用提供基礎數據和理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1 材料。香菇，購自市內萬德隆超市。

1.2 主要試劑。濃硫酸、苯酚、無水乙醇、過硫酸鉀、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸、碳酸氫鈉等試劑均為分析純。G-150 葡聚糖凝膠：上海伊卡生物科技有限公司；DEAE——52 纖維素和DPPH：福州飛凈生物科技有限公司；ABTS/ABTS 底物：上海士鋒生物科技有限公司。

1.3 儀器與設備。小型粉碎機：北京中興偉業儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱、電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；旋轉蒸發器：上海申順生物科技有限公司；紫外可見光分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；低速離心機：上海安亭科學儀器廠；恒流泵層析柱：上海夏美生化發展有限公司。

1.4 實驗方法。1.4.1 香菇柄多糖的提取。購買的香菇取柄，用清水洗凈表面的泥土，撕碎，在45℃下進行低溫烘干，粉碎，過40 目篩，稱取適量置于500mL 圓底燒瓶中，按照1:40（香菇柄：水）質量體積比加入蒸餾水混勻后放入水浴鍋中，在85℃的條件下浸提3h，抽濾后得濾液，對所得濾液進行減壓濃縮至一定體積后，加入適量無水乙醇，使樣品中無水乙醇濃度至90%，攪拌均勻后，4℃過夜，取出樣品離心收集沉淀，并用無水乙醇洗滌絮凝物沉淀3 次，將所得絮凝物在60℃真空干燥烘干至恒重得香菇柄粗多糖。1.4.2 香菇柄多糖含量的測定。多糖含量測定采用苯酚硫酸法，具體步驟參考文獻[7]。1.4.3 香菇柄多糖的純化。1.4.3.1 香菇柄多糖DEAE-52 纖維素離子交換層析對于粗多糖初步純化采用DEAE-52 纖維素離子交換層析，具體實驗步驟參考文獻[8]。準確稱取熱水提取法得到的粗多糖50mg 加5mL 蒸餾水溶解，4000r/min 離心10min，制成10mg/mL的多糖溶液，過0.45μm 濾膜后上樣，依次用蒸餾水、0.2mol/mL、0.4mol/mL NaCl，以1mL/min的洗脫速度洗脫，洗脫體積約100mL，收集洗脫液。并用苯酚硫酸法測其在490nm 波長下的吸光值，根據吸光值繪制洗脫曲線。1.4.3.2 香菇柄多糖葡聚糖凝膠過濾層析。為得到均一性多糖，將離子交換層析純化所得多糖采用G-150 凝膠過濾層析進一步純化，具體實驗步驟參考文獻[9]。準確稱取經離子交換層析初步純化得到的多糖20mg 加2mL 蒸餾水溶解，4000 r/min 離心10min，制成10mg/mL的多糖溶液，0.45μm 濾膜過濾后上樣。用蒸餾水進行洗脫，洗脫速度為0.2mL/min，收集洗脫液并用苯酚硫酸法測其在490nm 波長下的吸光值，根據吸光值繪制洗脫曲線，收集主要組分濃縮到原來體積的1/4。用蒸餾水透析24h，干燥至恒重后用于后續活性分析。1.4.4 香菇柄多糖抗氧化活性的測定。1.4.4.1 香菇柄多糖DPPH 自由基清除實驗[10]。準確稱取純化制備的香菇柄多糖用蒸餾水配制濃度分別為0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的多糖溶液待測，取3mL 多糖待測液與3mL 濃度為0.08mg/mL的DPPH 溶液混勻，放置2min，用無水乙醇做空白對照，測其517nm 下的吸光值（A1）；3mL 蒸餾水與3mLDPPH 所測吸光值為A2；3mL 多糖待測液與3mL 蒸餾水所測吸光值為A3；根據公式DPPH 自由基清除率=[1-(A3-A1)/A2]*100%計算香菇柄多糖的DPPH 清除率。1.4.4.2 香菇柄多糖ABTS 自由基抑制實驗[11]。取3mL 多糖待測液與5mLABTS 工作液搖勻，放置5min，用蒸餾水做空白對照，測其734nm 下的吸光值（A1′）；3mL 蒸餾水與5mL ABTS 工作液所測吸光值為A2′；3mL 蒸餾水與5mL 蒸餾水所測吸光值為A3′；根據公式抑制率=[1-(A3′-A1′)/A2′]*100%計算ABTS 自由基抑制率。

2 結果與分析

2.1 香菇柄多糖的提取結果。采用熱水提取對香菇柄中粗多糖進行提取后按照1:4的體積比加入無水乙醇對粗多糖濃縮液進行醇沉，可得到0.43g 多糖，得率為4.3%，即43mg/g。

2.2 香菇柄多糖的純化結果。2.2.1 DEAE-52 纖維素離子交換層析結果。將DEAE-52 纖維素離子交換層析收集到的各管洗脫液，在490nm 波長下測其吸光值，以洗脫液體積為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制洗脫曲線如圖1 所示。可見經過不同的洗脫液洗脫后，可得到一個明顯的峰。收集該峰對應的洗脫液，經旋轉蒸發濃縮至收集液原始體積的1/4 后醇沉后離心取下層沉淀，將沉淀干燥即得到經DEAE-52 纖維素純化得到的多糖，稱重得其質量為35mg，計算粗多糖經初步純化得率為70%，即香菇柄多糖得率3.01%。2.2.2 G-150 葡聚糖凝膠層析結果。將G-150 葡聚糖凝膠層析收集到的各管洗脫液在490nm 波長下測其吸光值并繪制洗脫曲線，結果如圖2 所示，經洗脫可得到一個明顯的峰，收集該峰對應的洗脫液，旋轉蒸發濃縮至收集液原始體積的1/4 后醇沉干燥即得到經凝膠過濾層析純化得到的多糖，稱重得其質量為15mg，計算初步純化的多糖經二次純化后得率為75%。聯合使用DEAE-52 纖維素離子交換層析和G-150 凝膠過濾層析對粗多糖進行純化結果可知每50mg 粗多糖純化后可獲得26.25mg的純多糖，最終多糖的純化得率為52.5%，即香菇柄多糖得率為2.26%。

圖1 DEAE-52 纖維素離子交換層析洗脫曲線

圖2 G-150 凝膠過濾層析洗脫曲線

2.3 香菇柄多糖抗氧化活性測定結果。2.3.1 香菇柄多糖對DPPH 自由基的清除效果。將純化所得多糖分別配制成濃度為0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的 多 糖 溶液，測得的DPPH 自由基清除率如圖3 所示，由圖可知香菇柄多糖DPPH 自由基清除率同陽性對照Vc 一樣均隨著待測樣本濃度的增加而逐漸增大，說明該多糖與DPPH的清除率存在較好的量效關系。其中香菇柄多糖的DPPH 自由基清除能力由0.2mg/mL的23.21%增加至濃度為1mg/mL的39.24%。2.3.2 香菇柄多糖對ABTS 自由基的清除效果。香菇柄多糖對ABTS 自由基的清除效果如圖4 所示，由圖可知香菇柄多糖ABTS 自由基清除率同陽性對照Vc 一樣均隨著待測樣本濃度的增加而逐漸增大，其中香菇柄多糖的ABTS 自由基清除能力由19.25%增加至33.45%。結合兩者之間清除率的具體數據可知雖然香菇柄中的多糖對DPPH的清除能力與Vc 存在一定差距，但仍表現出一定的抗氧化活性。

圖3 香菇柄多糖對DPPH 自由基的清除能力

圖4 香菇柄多糖對ABTS+自由基的清除能力

3 結論

利用熱水提取法和柱層析法對香菇中多糖進行提取純化，并對所得多糖的活性進行初步探索，最終香菇柄多糖得率可達2.26%。文中香菇柄多糖的提取純化方法和數據為相關多糖的制備提供了參考。由于多糖結構復雜，純化所得多糖的具體結構的解析是后續的研究方向之一。另外純化后的多糖表現出一定的DPPH 自由基和ABTS 自由基清除能力，且兩種自由基的清除效果與多糖濃度成較好的線性關系，可進一步從生化、細胞、動物多層次多水平綜合判斷建立香菇柄多糖抗氧化活性與結構和量之間的關系，進而為香菇柄多糖的相關研究提供指導，為高附加值香菇產品的獲得提供支持。