野生歐洲李離體葉柄再生體系的建立*

陳 曦，耿文娟

（新疆農業大學園藝學院，烏魯木齊830052）

野生歐洲李（Prunus domesticaL.）俗名野酸梅，屬于薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）植物，為灌木或小喬木，樹高1.0～2.5 m，是新疆珍稀的野生植物之一[1-2]。自1980 年施麗首次在新疆新源縣交吾托海野果林發現，認為新疆伊犁天山野果林是歐洲李的唯一起源地[3-4]。之后有學者陸續發現了其余6 處生存分布點，據調查表明，野生歐洲李僅分布在我國新疆伊犁地區的新源縣和鞏留縣，零散分布，個別分布點僅有幾株，其只有在溫濕的陰坡面或近水邊才能較好地生存，抗性較弱，且生長狀況逐年衰弱[5-8]。野生歐洲李因其含酸量高，適合加工成李產品，也具有藥用和營養價值，有一定的經濟效益，但野生分布的歐洲李還沒有開發利用[6,9]。當前由于生存環境惡劣、過度放牧開墾和人為破壞等因素，造成野生歐洲李種群數量逐年減少，生存面積驟縮，已處于瀕危狀態[10]。研究并建立多層次保護保存體系，對新疆野生歐洲李果樹資源的保護具有重要的現實意義。

近年來，植物組織培養技術在我國發展迅猛，不僅繁殖周期短、速度快，人為控制下可實現工廠化批量生產育苗，也對新品種的遺傳改良、種質資源的保存和瀕危植物種群數量的擴大有重要意義[11-13]。如今在核果類果樹育種應用上也越來越廣泛。在桃[14-15]、櫻桃[16-17]和杏[18-19]等果樹中報道較多，而關于李的研究報道較少，Nowak 等[20]以歐洲李試管苗上部第2～3 片完全展開的帶葉柄的葉片為試材，得到再生植株。櫻桃李作為歐洲李的親本之一，劉崇琪等[21]采用新疆野生櫻桃李試管苗葉片為試材也得到了再生植株。姚延興[22]則以歐洲李‘Tardicots’的葉柄為試材，不定芽的再生率可達83.33%。而針對野生歐洲李葉柄再生的研究還未有報道，組培苗葉柄和野外采摘的葉柄材料相比，污染低，分化能力強。因此，以近年來對野生歐洲李莖段和葉片組織培養的研究為基礎[23-25]，采用野生歐洲李試管苗幼嫩葉片上的葉柄作為外植體，探究暗培養時間、基礎培養基類型、植物生長調節劑種類及配比對葉柄離體再生的影響，期望建立高效穩定的野生歐洲李葉柄離體培養再生植株體系，對野生歐洲李資源的保護提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新疆野生歐洲李組培苗材料采自新疆伊寧市新源縣交吾托海（野生歐洲李原生分布地之一），25 d 左右繼代1 次。取葉齡在25～30 d 的組培苗，選取上部分完全展開的3～6 片幼嫩葉片的葉柄作為外植體，接種到各處理的培養基中，培養箱溫度為（25±1）℃。

1.2 試驗方法

1.2.1 暗培養時間的篩選

設計5 組暗培養時間，依次為0、7、14、21、28 d，每個處理接種30 個外植體。培養基配方為B5＋0.2 mg/L 6-BA＋1.5 mg/L NAA＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂，pH 值為5.5±0.1，30 d 后統計離體葉柄不定芽誘導率，并觀察記錄生長狀況。

不定芽誘導率（%）＝（葉柄出芽數/接種總數）×100

1.2.2 基礎培養基類型的篩選

選取B5、WPM、MS（合肥巴斯夫生物科技有限公司）3 種不含瓊脂和蔗糖的基礎培養基，每個處理接種30 個外植體。培養基配方同1.2.1，30 d 后統計離體葉柄不定芽誘導率，并觀察記錄生長狀況。

1.2.3 初代培養中植物生長調節劑濃度配比的篩選

初代培養中基礎培養基選用B5＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂，植物生長調節劑選取6-BA（0.1、0.2、0.3 mg/L）和NAA（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L），共15 個處理，每個處理接種30 個外植體，30 d 后統計離體葉柄不定芽誘導率，并觀察記錄生長狀況。

1.2.4 不定芽增殖培養中植物生長調節劑濃度配比的篩選

不定芽增殖培養中基礎培養基選用B5＋30 g/L蔗糖＋7 g/L 瓊脂，植物生長調節劑選取6-BA（0.5、0.6、0.7 mg/L）和NAA（0.2、0.3 mg/L），共6 個處理，每個處理接種15 個不定芽，30 d 后統計離體葉柄再生不定芽增殖系數，并觀察記錄生長狀況。

不定芽增殖系數＝30 d 后不定芽總數/接種前不定芽數

1.2.5 生根培養中植物生長調節劑濃度配比的篩選

待離體葉柄誘導的不定芽苗長到1.5 cm左右轉接到繼代培養基中，繼代培養1～2 次后可誘導生根。生根培養中基礎培養基選用1/2 MS 或B5＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂，植物生長調節劑選取IBA（0.4、0.5、0.6、0.7 mg/L），共8 個處理，每個處理接種10 瓶，每瓶接種1～2 個不定芽苗，30 d 后統計離體葉柄再生苗生根率，并觀察記錄生長狀況。

2 結果與分析

2.1 不同暗培養時間對離體葉柄誘導不定芽的影響

不同暗培養時間對葉柄不定芽誘導率有明顯影響，未經過暗培養的葉柄不定芽誘導率為0，褐化嚴重；暗培養21 d 處理的葉柄再生的不定芽長勢良好，不定芽誘導率最高，為33.3%；而暗培養28 d 處理的葉柄完全愈傷化，并分化出少量不定芽（表1，圖版1-A）。

表1 不同暗培養時間對離體葉柄誘導不定芽的影響

2.2 不同基礎培養基類型對離體葉柄誘導不定芽的影響

葉柄只有在B5 培養基中再生出不定芽，誘導率為26.7%，不定芽長勢好，未分化出不定芽的葉柄全部愈傷化，有松軟質地和偏硬質地2 種愈傷組織；在WPM 和MS 培養基中葉柄不定芽誘導率皆為0，愈傷組織生長狀況也較差（表2）。

表2 不同基礎培養基類型對離體葉柄誘導不定芽的影響

2.3 初代培養中不同植物生長調節劑濃度配比對離體葉柄誘導不定芽的影響

在B5 培養基中，添加不同濃度配比的植物生長調節劑6-BA 和NAA對葉柄再生不定芽有明顯影響，添加0.1 mg/L 6-BA 時，僅有處理1 再生出不定芽，長勢較弱，最后死亡。添加0.2 mg/L 6-BA時，處理7、8、9、10 均有不定芽再生，其中處理8 的誘導率最高，為30.0%，不定芽長勢好，生長健壯（圖版1-B、C）；處理9 有不定芽再生，同時也有不定根再生（圖版1-D），隨著NAA 濃度的增加，不定芽發生玻璃化現象。添加0.3 mg/L 6-BA 時，5 組處理均無不定芽再生，部分葉柄愈傷化（表3）。

表3 初代培養中不同植物生長調節劑濃度配比對離體葉柄誘導不定芽的影響

2.4 增殖培養中不同植物生長調節劑濃度配比對不定芽增殖的影響

以B5 作為增殖培養中的基礎培養基，隨著植物生長調節劑6-BA 濃度的增加，不定芽增殖效果更明顯，在添加0.7 mg/L 6-BA 時的增殖系數最高，為2.8，不定芽長勢好，葉綠且苗高；添加0.3 mg/L NAA 效果優于0.2 mg/L NAA，處理2、4、6 的增殖系數明顯高于相同6-BA 濃度的其他3 個處理，梢的伸長生長效果也好，利于后續繼代培養（表4）。添加0.7 mg/L 6-BA 和0.3 mg/L NAA 的培養基中不定芽增殖和生長效果較好（圖版1-E）。

表4 增殖培養中不同植物生長調節劑濃度配比對不定芽增殖的影響

2.5 在B5 和1/2 MS 培養基中IBA 濃度對不定芽苗生根的影響

在B5 和1/2 MS 培養基中添加不同濃度的IBA，所有處理均有生根現象，但長勢不一，IBA 濃度相同的條件下，在B5 培養基中生根效果好于1/2 MS培養基，但這2 個培養基中生根率最高都為20%，隨著IBA 濃度的增加，長勢也越差，葉片發黃，根部褐化。在B5＋0.6 mg/L IBA 處理中，葉柄生根苗長勢好，20 d 左右后基部有根的發生，單根現象居多，培養一段時間根長8.0 cm 左右，且單根上有較多側根，有5～8 條，根基部都伴有少許愈傷組織（表5，圖版1-F）。

表5 在B5 和1/2 MS 培養基中IBA 濃度對不定芽苗生根的影響

3 討 論

3.1 暗培養時間對野生歐洲李離體葉柄再生不定芽的影響

在核果類果樹葉片組織培養的報道中，暗培養是影響葉片誘導愈傷組織和不定芽再生的重要因素之一。劉崇琪等[21]在新疆櫻桃李組培苗葉片誘導不定芽研究中發現，未經暗培養的葉片不能誘導不定芽，經過14 d 暗培養后的葉片誘導不定芽效果最好。劉航空等[26]也在誘導油桃葉片胚性愈傷組織的研究中發現，經暗培養21 d 時，有利于愈傷組織的產生，并進一步分化再生了8.0%的不定芽。歐洲李試管苗葉片（帶葉柄）離體培養也經過21 d 暗培養，誘導出不定芽并獲得了再生植株[22]。本試驗也得到了相同結果，發現在暗培養21 d 時，葉柄可直接再生不定芽或經過少量愈傷組織再生出不定芽，誘導率為33.3%。但在暗培養28 d 時，葉柄完全愈傷化，愈傷組織質地較硬，也再生出少量不定芽，而暗培養時間太短，則不能再生不定芽，說明只有適宜的暗培養時間才能使外植體再生不定芽。

3.2 基礎培養基類型對野生歐洲李離體葉柄再生的影響

基礎培養基是保證外植體存活狀況與生理活動的最基本物質，在核果類組織培養中，MS 培養基應用較廣泛，不同樹種選用的基礎培養基也不同。在李組織培養中，鄒英寧等[27]研究表明，1/2 MS培養基和WPM 培養基對‘海灣紅寶石’李莖段離體再生效果較好，生根率分別為10.4%和10.1%，生根倍數均為2.0。孫清榮等[28]對歐洲李‘紅艷1 號’莖段初代培養中發現基礎培養基QL 比MS 有效，增殖培養時MS 培養基效果好于QL 和WPM。吳建華等[29]以歐洲李幼嫩莖段為試材，叢生芽的誘導和增殖在MS 培養基中效果最佳。在本試驗中，比較了B5、MS 和WPM 3 種基礎培養基對離體葉柄不定芽誘導的影響，發現只有在B5 培養基中再生出不定芽，MS 和WPM 培養基中不定芽誘導率均為0；在B5 和1/2 MS 培養基中均有生根現象，但在1/2 MS培養基中長勢較弱，表明B5 培養基對野生歐洲李離體葉柄再生效果最好，和前人研究結果一致。

3.3 植物生長調節劑種類及其濃度配比對野生歐洲李離體葉柄再生的影響

植物生長調節劑種類及其濃度配比對外植體愈傷組織的誘導、不定芽分化起關鍵作用，不同的品種選用的植物生長調節劑濃度也不同，也影響其生長狀況。彭麗萍等[30]選用6-BA＋2,4-D 組合對中國櫻桃試管苗葉片誘導愈傷組織，在部分含有葉柄的葉基部誘導率可達100%，在中國李‘Nubiana’離體葉柄培養中添加0.2 mg/L TDZ＋1.65 mg/L 2,4-D 對不定芽再生效果好，而在櫻桃李中添加1.8 mg/L 2,4-D 對不定芽再生效果好，二者誘導率分別為31.7%和36.7%[15]。在前期預試驗中也選用7.5 mg/L TDZ，對愈傷組織誘導較好，但未誘導出不定芽，而選取0.2 mg/L 6-BA＋1.5 mg/L NAA 對野生歐洲李離體葉柄不定芽再生效果好，當添加2.0 mg/L NAA 時，離體葉柄直接分化出不定根。中國李‘帥李’在生根培養基中添加0.5 mg/L NAA，生根率為33.3%[31]。本研究中生根培養基中添加IBA 對不定芽誘導生根效果好，但生根率僅有10%～20%。在后續的研究中，可不斷優化基礎培養基類型和植物生長調節劑種類及其濃度配比來提高生根率。

4 結 論

野生歐洲李試管苗葉柄最佳暗培養時間為21 d，適合初代培養誘導不定芽再生的培養基為：B5＋0.2 mg/L 6-BA＋1.5 mg/L NAA＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂，誘導率為30.0%；適合不定芽增殖的培養基為：B5＋0.7 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L NAA＋30 g/L蔗糖＋7 g/L 瓊脂，增殖系數為2.8；適合不定芽生根的培養基為：B5＋0.6 mg/L IBA＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂，生根率為20%，培養基pH 值均為5.5。