配有固定波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器的毛細(xì)管電泳儀計(jì)量檢定問(wèn)題及分析

趙新穎 趙少雷 丁曉靜 趙海波* 林 青 袁 騉

(1.北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京 100176；2.北京市計(jì)量檢測(cè)科學(xué)研究院，北京 100012；3.北京市疾病預(yù)防控制中心，北京 100013)

毛細(xì)管電泳(Capillary Electrophoresis，CE)是以微米級(jí)內(nèi)徑的石英毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的分離技術(shù)。憑借分離模式多、分析速度快、分離柱效高、樣品和試劑用量省、自動(dòng)化程度高等最基本和最高效的優(yōu)勢(shì)，CE在食品、環(huán)境、尤其是生物醫(yī)藥方面得到廣泛應(yīng)用，美國(guó)、英國(guó)、俄羅斯以及我國(guó)《藥典》中均有相關(guān)方法收錄[1, 2]。隨著CE技術(shù)潛能的不斷發(fā)揮，我國(guó)生產(chǎn)毛細(xì)管電泳儀的廠家已近40家[3]，用戶對(duì)毛細(xì)管電泳儀的計(jì)量溯源需求也日益增加。毛細(xì)管電泳儀可依據(jù)《毛細(xì)管電泳儀檢定規(guī)程(JJG 964-2001)》[4](簡(jiǎn)稱：規(guī)程)進(jìn)行檢定/校準(zhǔn)，共需計(jì)量15個(gè)項(xiàng)目。該規(guī)程自2001年10月1日實(shí)施至今已近20年，與當(dāng)前商品化的毛細(xì)管電泳儀有一些不匹配之處，影響了規(guī)程的推廣和使用。本文針對(duì)這些問(wèn)題，以CE理論為基礎(chǔ)，以實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，對(duì)配有固定波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器的毛細(xì)管電泳儀(CE-UV)的中心波長(zhǎng)誤差、濾光片半寬度(半峰寬)、靜態(tài)基線漂移、基線噪聲、檢測(cè)限、定性和定量測(cè)量重復(fù)性共計(jì)7個(gè)項(xiàng)目的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析討論。對(duì)產(chǎn)生的問(wèn)題嘗試了方法改進(jìn)，為此類毛細(xì)管電泳儀的計(jì)量檢定/校準(zhǔn)及規(guī)程修訂提供了參考。

1 儀器和試劑

兩臺(tái)P/ACETMMDQ型、1臺(tái)P/ACETMMDQ Plus型、1臺(tái)PA800 Plus型毛細(xì)管電泳儀，均配有固定波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(標(biāo)示波長(zhǎng)：200 nm、214 nm、230 nm、254 nm、280 nm)，工作站；體積計(jì)算：Beckman CE Expert，Lambda 950型紫外可見(jiàn)近紅外分光光度計(jì)；PHS-3C型pH計(jì)；EX225D型天平；未涂層石英毛細(xì)管。

維生素B6純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW 15003, C8H11O3N·HCl，Vitamin B6， VB6)外購(gòu)；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2 實(shí)驗(yàn)條件

20 mmol/L Na2HPO4水溶液：按規(guī)程附錄A.4配制，室溫放置1h后使用，20℃保存，有效期5天。

維生素B6標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液：按規(guī)程附錄A.3配制質(zhì)量濃度為1.0×10-4g/mL的樣品溶液，溶劑分別為20 mmol/L Na2HPO4溶液和水。室溫放置1 h后使用，每次使用前新鮮配制。

電泳參數(shù)(根據(jù)需要設(shè)置)：樣品盤(pán)溫度20℃;分離溫度20℃;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;分離電壓+10 kV;壓力進(jìn)樣1.0 psi × 5 sec。

毛細(xì)管的處理：新毛細(xì)管使用前依次用1 mol/L NaOH、0.1 mol/L NaOH、水和20 mmol/L Na2HPO4水溶液20psi沖洗10 min，重復(fù)兩次。每次使用前依次用0.1M NaOH、水和20 mmol/L Na2HPO4水溶液20psi沖洗5 min。使用后依次用0.1 mol/L NaOH、水和空氣20psi沖洗3 min。間隔進(jìn)樣時(shí)，用20 mmol/L Na2HPO4水溶液20 psi沖洗3 min。

3 結(jié)果和討論

3.1 固定波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器中心波長(zhǎng)和半寬度的檢定

取出毛細(xì)管電泳儀紫外檢測(cè)器配置的濾光片，按規(guī)程中指定的《干涉濾光片(JJG 812-1993)》[5]檢測(cè)中心波長(zhǎng)(峰值波長(zhǎng))和半峰寬，標(biāo)示波長(zhǎng)和測(cè)得的中心波長(zhǎng)之差即為中心波長(zhǎng)誤差。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種型號(hào)的4臺(tái)毛細(xì)管電泳儀配置的17塊濾光片中，標(biāo)示波長(zhǎng)200 nm、214 nm、230 nm、254 nm和280 nm濾光片各有1塊中心波長(zhǎng)誤差大于規(guī)程中規(guī)定的 ± 2nm；3塊200 nm和2塊214 nm濾光片的半峰寬大于規(guī)程中規(guī)定的15 nm(表1)。針對(duì)上述情況，建議更換符合要求的濾光片，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

表1 3種型號(hào)的4臺(tái)毛細(xì)管電泳儀配置的17塊濾光片檢定結(jié)果

3.2 靜態(tài)基線漂移和基線噪聲的檢定

規(guī)程對(duì)靜態(tài)基線漂移和基線噪聲檢定做出了描述，實(shí)際上動(dòng)態(tài)基線漂移和動(dòng)態(tài)短期噪聲更能反映毛細(xì)管電泳儀運(yùn)行時(shí)的綜合狀態(tài)。本文在毛細(xì)管電泳儀運(yùn)行狀態(tài)下，對(duì)上述參數(shù)進(jìn)行采集。根據(jù)《高效液相色譜儀(GBT26792-2019)》[6]中4.5.1.3.2所示計(jì)算方法，得到動(dòng)態(tài)基線漂移值6.96 × 10-4AU/h(圖1A)；選取基線中噪聲較大的5 min，以1 min為界畫(huà)繪制平行包絡(luò)線，其寬度平均值2.6 × 10-5AU(n = 5)為動(dòng)態(tài)短期基線噪聲(圖1B)；二者均符合規(guī)程要求。

圖1 動(dòng)態(tài)基線漂移(A)和檢測(cè)器噪聲(B)測(cè)定的電泳圖圖1B(× 10-5 AU)a：3.1； b：0.3；c：2.5；d：3.6；e：3.3(電泳條件見(jiàn)表2改進(jìn)方法部分)

3.3 檢測(cè)限、定性和定量測(cè)量重復(fù)性檢定

3.3.1不明確參數(shù)

規(guī)程中一些重要參數(shù)不明確對(duì)檢定造成了操作困難。(1)毛細(xì)管材質(zhì)和規(guī)格。現(xiàn)用商品化毛細(xì)管有未涂層以及多種涂層的石英毛細(xì)管，甚至有聚四氟乙烯材質(zhì)的毛細(xì)管，規(guī)程中未提及。此外，規(guī)程中只提到75 μm × 40 cm，未指明40 cm是毛細(xì)管的有效長(zhǎng)度還是總長(zhǎng)度。(2)毛細(xì)管的處理方法。毛細(xì)管的活化和進(jìn)樣前的清洗程序是影響CE實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的重要因素，規(guī)程中未提及處理方法。(3)溶液保存條件和有效期。例如，20 mmol/L Na2HPO4水溶液為堿性，易吸收空氣中的CO2而導(dǎo)致pH發(fā)生變化，影響定性定量測(cè)量的重復(fù)性，規(guī)程中沒(méi)有對(duì)所使用溶液的保存期和有效期進(jìn)行說(shuō)明。(4)進(jìn)樣體積。CE的進(jìn)樣體積一般為納升級(jí)，是決定檢測(cè)限的重要因素，規(guī)程中僅給出“20 cm高差持續(xù)180 sec”，沒(méi)有折算到納升。

3.3.2不合理參數(shù)

規(guī)程中的不合理參數(shù)造成了實(shí)驗(yàn)重復(fù)和重現(xiàn)困難。(1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液不穩(wěn)定。VB6不耐高溫，遇堿易破壞[7]，在規(guī)程選定的20 mmol/L Na2HPO4水溶液(pH約為9.30)中不穩(wěn)定，導(dǎo)致定量結(jié)果重復(fù)性不能滿足要求。(2)背景電解質(zhì)pH不在最佳緩沖范圍內(nèi)。CE分離必須在緩沖溶液中進(jìn)行，以得到較好的定性和定量重復(fù)性[2]。Na2HPO4的pKa2為7.20，pKa3為12.36，理論上的最佳緩沖范圍應(yīng)為pKa± 1，即 6.20

3.3.3方法改進(jìn)

使用P/ACETMMDQ Plus型毛細(xì)管電泳儀按規(guī)程操作，VB6為1.0 × 10-4g/mL時(shí)，電泳峰不尖銳，出現(xiàn)平頭峰(圖2A)，這可能是進(jìn)樣量過(guò)大造成的過(guò)載現(xiàn)象；VB6為1.0 × 10-5g/mL時(shí)，電泳峰仍然不尖銳，出現(xiàn)圓頭峰和分叉峰(圖2C)，這可能是樣品介質(zhì)電導(dǎo)值和背景電解質(zhì)電導(dǎo)值無(wú)差異造成的；VB6為2.0×10-6g/mL時(shí)，無(wú)法獲得積分，檢測(cè)線無(wú)法滿足要求(圖2E)。總之，該條件下基線噪音過(guò)高，盡管定性重復(fù)性符合要求，但峰面積和峰高的定量重復(fù)性、檢測(cè)限都無(wú)法達(dá)到要求(表2)，儀器性能被低估。

表2 規(guī)程方法和改進(jìn)方法參數(shù)與指標(biāo)對(duì)比

通過(guò)優(yōu)化毛細(xì)管內(nèi)徑和長(zhǎng)度、樣品介質(zhì)、分離電壓等參數(shù)，VB6為1.0 × 10-4g/mL時(shí)，峰型變尖銳，但峰面積和峰高變化過(guò)大(圖2B)，也可能是過(guò)載造成的；VB6為1.0 × 10-5g/mL時(shí)，峰型尖銳、對(duì)稱性好，定性和定量重復(fù)性都能獲得符合要求的結(jié)果(圖2D)；VB6為2.0 × 10-6g/mL時(shí)，檢測(cè)限得到大幅度提升(圖2F)，這也證明了構(gòu)建背景電解質(zhì)與樣品介質(zhì)電導(dǎo)差異的重要性。事實(shí)上，改進(jìn)之后的方法依然不夠完善，還需要根據(jù)CE原理進(jìn)行篩選和優(yōu)化，從而更加科學(xué)、客觀地評(píng)價(jià)儀器性能。

圖2 規(guī)程方法(A)和改進(jìn)方法(B)的電泳圖A、C、E：VB6的20 mmol/L Na2HPO4水溶液； B、D、F：VB6的水溶液

4 小結(jié)

《毛細(xì)管電泳儀檢定規(guī)程(JJG 964- 2001)》中不明確與不合理的參數(shù)限制了規(guī)程的使用，尤其是對(duì)定量重復(fù)性和檢測(cè)限的影響極大。經(jīng)驗(yàn)豐富的使用者能夠通過(guò)方法優(yōu)化克服，而初學(xué)者和經(jīng)驗(yàn)不足的使用者，在使用該規(guī)程時(shí)存在較大困難。因此，建議規(guī)程及時(shí)進(jìn)行修訂，選用更科學(xué)合理的CE方法，并對(duì)其進(jìn)行細(xì)化，以便更好地滿足檢定和校準(zhǔn)的需求，促進(jìn)CE技術(shù)的廣泛應(yīng)用，保障我國(guó)CE儀器量值溯源高質(zhì)量發(fā)展。

連續(xù)可調(diào)波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器毛細(xì)管電泳儀的檢定將在下篇文章詳述。