基于網絡藥理學研究鱉甲煎丸抗肝纖維化的作用機制

丁茂鵬， 韋凌霞， 王志旺， 姚 楠， 龐亞蓉

(甘肅中醫藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000)

肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是指由多種致病因素所致肝內纖維組織異常增生的病理過程，其持續發展可導致肝硬化[1]，最好的治療方法是阻止或逆轉其纖維化過程。目前抗肝纖維化的西藥療效尚不明確，而中醫藥在治療慢性復雜性疾病方面有明顯優勢[2]。源于《金匱要略》的鱉甲煎丸具有活血化瘀、軟堅散結、補益虛損、祛痰除濕之效，是傳統中醫治療瘧母的專方，現代多用于治療肝纖維化，臨床上取得了顯著療效[3]。本研究采用網絡藥理學，從“多成分-多靶點-多通路”的角度探討鱉甲煎丸治療肝纖維化的理論依據。

1 材料與方法

1.1 鱉甲煎丸關鍵成分的篩選 以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.36、藥物半衰期(HL)≥4為條件，在TCMSP數據庫對鱉甲煎丸中16味藥材的成分進行篩選，同時查閱文獻，對具有抗肝纖維化的成分進行了補充。對于6味動物藥、1味礦物藥，在CNKI、萬方數據庫中篩選近十年標注有“抗炎”“抗肝纖維化”作用的相關成分。

1.2 鱉甲煎丸靶點的查詢與成分-靶點網絡的構建 通過TCMSP、CTD、UniProt數據庫，查詢篩選所得成分的作用靶點及其基因，將其導入Cytoscape3.6.1軟件，構建成分-靶點網絡，化合物及其靶點由節點表示，2個節點之間的關系由邊線表示，每個節點的重要性通過拓撲參數度數進行評判，度數越大，該節點在網絡中越重要[4]，篩選出度數靠前者作為核心成分。

1.3 肝纖維化相關靶點的篩選與疾病-中藥-成分-關鍵靶點網絡的構建 在GeneCards、CoolGene數據庫中輸入“hepatic fibrosis”檢索肝纖維化的相關靶點，同時進行相關度分析。將鱉甲煎丸成分、肝纖維化的相關靶點進行匹配映射，獲得關鍵成分治療肝纖維化關鍵靶點。將疾病、中藥、關鍵成分及關鍵靶點導入Cytoscape數據庫中，構建疾病-中藥-成分-靶點網絡。

1.4 GO富集分析、KEGG通路分析 利用DAVID平臺對關鍵靶點進行基因本體論(GO)分析、KEGG通路分析，從生物過程、分子功能、細胞組成3個模塊進行GO富集分析，采用OriginPro軟件將富集結果靠前的條目繪制成條形圖。

1.5 PPI網絡的構建與分析 在STRING數據庫輸入關鍵靶點，限定物種為人，得到蛋白相互作用(PPI)網絡圖，將結果以TSV格式導出，借助Cytoscape軟件計算網絡的拓撲參數，并篩選度數靠前的靶點作為后續分析的核心靶點。

1.6 分子對接分析 在Pubchem數據庫中詢查核心成分的3D結構，將它與核心靶點導入Systems DockWeb Site中進行分子對接，獲得對接驗證及其對接打分值(Docking score)，大于4.25表明具有一定的結合活性，大于5.0表明分子與靶點具有較好的結合活性，大于7.0表明分子與靶點的結合模型具有強烈的穩定性及活性[5]。

2 結果

2.1 鱉甲煎丸關鍵成分的篩選 在TCMSP、CNKI數據庫中，篩選出鱉甲煎丸植物藥中抗纖維化活性較高的70種成分，另外動物藥、礦物藥共有35種，去掉重復項后得到78種關鍵成分，見表1～2。

表1 鱉甲煎丸植物藥中關鍵成分

表2 鱉甲煎丸動物藥、礦物藥中關鍵成分

2.2 鱉甲煎丸靶點預測 將鱉甲煎丸關鍵成分輸入TCMSP數據庫得到對應的靶點，通過Uniprot數據庫矯正為標準名稱，共得到1 777個靶點；部分動物藥、礦物藥的化學成分在CTD數據庫中查詢，共得到276個靶點。將在TCMSP與CTD中檢索到的靶點合并，去除重復項后得到478個靶點。將“2.1”項下78種關鍵成分與478個靶點導入Cytoscape軟件來構建成分-靶點網絡圖，見圖1，紅色為靶點，藍色為鱉甲煎丸成分，可知共有555個節點，2 050條邊，度數靠前的成分是鱉甲煎丸治療肝纖維化關鍵成分，取前9種進行后續研究，見表3。

表3 鱉甲煎丸核心成分

圖1 鱉甲煎丸成分-靶點網絡

2.3 肝纖維化靶點的預測 通過GeneCards、CoolGene數據庫，預測出肝纖維化相關靶點分別為3 926、1 011個，將其與“2.2”項下478個靶點進行交集，得到80個共有靶點，即為鱉甲煎丸抗肝纖維化的關鍵靶點。將肝纖維化、中藥、成分、關鍵靶點導入Cytoscape軟件中，構建疾病-中藥-成分-靶點網絡圖，見圖2。

圖2 鱉甲煎丸疾病-中藥-成分-靶點網絡

2.4 GO富集分析、KEGG信號通路分析 將“2.3”項下80個關鍵靶點輸入DAVID網站，進行GO富集分析與KEGG信號通路分析。GO富集分析發現，與鱉甲煎丸抗肝纖維化相關的關鍵靶點涉及167條生物過程、28種分子功能、20個細胞組分；KEGG通路分析顯示，這些關鍵靶點涉及到107條信號通路，其中前10條過程和通路見圖3。

圖3 鱉甲煎丸GO富集分析、KEGG信號通路分析(前10條)

2.5 PPI網絡的構建 將“2.3”項下80個關鍵靶點導入STRING網站進行PPI網絡分析，同時借助Cytoscape軟件篩選核心靶點。結果顯示，PPI網絡共涉及79個節點，333條邊，平均節點度為8.43，取前10個靶點進行后續研究，見圖4、表4。

表4 鱉甲煎丸抗肝纖維化的核心靶點(前10個)

圖4 鱉甲煎丸PPI網絡圖

2.6 分子對接分析 表5顯示，對接分數4.25～5.0的有7個，5.0～7.0的有25個，大于7.0的有4個；鱉甲煎丸成分、靶點基因的對接分數均大于4.25，大部分集中于5.0～7.0之間。

表5 鱉甲煎丸核心成分與核心靶點的分子對接

3 討論

本研究采用網絡藥理學，依托化學成分、靶點及其生物信息等多個數據庫，富集鱉甲煎丸治療肝纖維化的成分、靶點及其相關信號通路，探討鱉甲煎丸治療肝纖維化的作用機制。結果顯示，β-谷甾醇、槲皮素、山柰酚等9種化學成分匹配到較多的肝纖維化靶點，是鱉甲煎丸治療肝纖維化的核心成分，這與目前的相關研究結果一致。β-谷甾醇具有抗氧化，抗炎和免疫調節作用，可誘導人肝癌HepG2/ SMMC-7721細胞凋亡，抑制脂多糖/D-半乳糖胺誘導的急性肝損傷[6-7]。槲皮素抑制肝星狀細胞活化緩解肝纖維化，通過抑制TGF-β1/Smads信號通路并激活PI3K/Akt信號通路來緩解膽管結扎或CCl4誘導的肝纖維化自噬作用[8]。山柰酚通過下調IL-13和COL1基因表達，抑制膠原蛋白合成，同時上調MMP-2基因表達而促進膠原分解，發揮治療血吸蟲肝纖維化的作用[9]。

在作用機制分析過程中，發現IL-6、TNF及MAPK等10個靶點發揮核心作用，它們主要涉及肝炎、肝纖維化及肝硬化等病理過程。IL-6是與肝纖維化關系最密切的細胞因子，能激活STAT3信號轉導通路[10]。IL-6通過mTOR/STAT3信號途徑，刺激CD4+T淋巴細胞胞內蛋白STAT3磷酸化及表達增加，STAT3磷酸化后形成二聚體進入細胞核，通過調節基因轉錄，促進Th17細胞增殖、分化，加速Th17細胞表達IL-17，造成肝衰竭[11]。TNF-α主要由淋巴細胞、單核巨噬細胞分泌，能夠刺激內毒素誘導細胞因子IL-6、IL-8等的表達，進而介導肝細胞炎性反應，促進肝纖維化的發展[12]。MAPK1是MAPK信號通路的重要信號通路蛋白，主要參與細胞增殖、生長及分化等過程的調控，在癌癥的發展過程中具有促進作用[13]。上述因子之間又存在著密切的關系，如JAK/STAT3通路與MAPK通路協同調節炎癥介質TNF-α的轉錄活性[14]。EGFR和TP53與腫瘤的發生、發展關系十分緊密，EGFR是原癌基因c-erbB-1(HER-1)的表達產物，參與肝組織再生過程[15]，而TP53在腫瘤發生、發展及轉移過程中發揮重要作用[16]。通路富集的結果顯示，鱉甲煎丸關鍵成分作用的關鍵靶點分布于不同的信號通路，可通過多通路協調發揮抗肝纖維化作用。此外，本研究采用了分子對接技術，探討了核心成分與核心靶點之間的結合能力，為鱉甲煎丸所含核心成分治療肝纖維化提供了理論依據。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學方法，對鱉甲煎丸治療肝纖維化多成分-多靶點的復雜網絡關系進行了系統分析，結果提示鱉甲煎丸通過多種成分、多靶點、多通路發揮抗肝纖維化的綜合作用。