小麥蛋白雙酶酶解制備高抗氧化性小麥肽研究

劉世欣 馮軍偉 董得平 王曉飛 尚海

摘要：為了能成功制備出抗氧化性更高的小麥肽，本課題應用分布酶解方法，基于響應面法完善擇堿性及風味蛋白酶兩種酶的最佳酶解工藝參數，超濾技術分級分離最后獲得的酶解物。最后所得的酶解物自由基DPPH、O2-、·OH清除率分別75.37%、74.52%、76.28%。綜合分析，認為小麥蛋白酶解物自身的抗氧化活性處于較高水平。

關鍵詞：小麥蛋白;雙酶酶解;小麥肽;抗氧化性

引言

有研究發現，小麥蛋白的蛋白質含量達到75%-85%，麥醇溶蛋白、麥谷蛋白是其主要成分。因為小麥蛋白自身特殊的結構與氨基酸構成，造成分子內疏水區偏大，以致其在水內的溶解性整體偏差。為全面提升其加工與功能屬性，既往多采用物理法、化學法及酶解法進行。相比之下，蛋白質酶解改性反應過程平穩、效率高、便于控制、產物可靠性較高。小麥肽作為酶解的主要產物之一，抗氧化性是其主要的功能屬性，自由基DPPH、O2-、·OH清除情況等均是反應抗氧化性的常用指標，本課題應用了分步酶解方法，研究酶解制備小麥肽的抗氧化性。

1. 概念分析

1.1 小麥蛋白

蛋白質占小麥總量的13%左右，主要由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白等構成，其中清蛋白主要存在于胚內，其溶于水于稀鹽溶液，熱穩定性偏低，溫度達60℃時可變性。球蛋白在小麥蛋白總量中占比6%-10%，溶于10%NaCI，但和水不相溶。麥醇溶谷蛋白占比約40%-50%，為小麥作物的主要蛋白，和水及中性鹽溶液均，但溶70%-90%乙醇。

1.2 小麥肽

這是一種始源于小麥蛋白的植物性生物活性肽，內含人體必需的15種氨基酸，其具有水溶性好、容易吸收、生物活性強等諸多特點。既往已經有研究證實，人體攝入的蛋白質被自體消化系統內的酶作用后，絕非是以氨基酸的形式被吸收，吸收形式以低肽為主。

2. 操作方法

（1）分步酶解：把100g小麥蛋白與定量去離子水相混合，放置在水浴鍋內保溫，1.0mol/L NaOH將容易調整至設計pH值，隨后加入適量酶進行酶解，以上過程中每間隔20min就調整1次pH值，使其維持恒定;充分攪拌酶解，酶解整體完成后，沸水持續滅酶10min，調整溫度與pH至到風味蛋白酶的最適條件（溫度50℃、pH6.5）;添加定量風味蛋白酶進行第2步酶解，pH調整、攪拌、滅酶操作同第1步;自然冷卻后2800r/min離心處理20min，提取上清液充分冷凍干燥，低溫（-20℃）環境下保存以備用。

（2）檢測自由基清除率：具體是參考HALLIWELL等研究中形成的方法測定1，1一二苯基一2一三硝基苯肼（DPPH）、超氧陰離（O2-、）、羥自由基（·OH）的清除率。

（3）設計響應面試驗：①堿性蛋白酶：選出影響自由基清除率的主要因素，有底物濃度X1、酶濃度X2、反應時間X3作為自變量;DPPH、O2-、·OH清除率（Y1、Y2、Y3）作為因變量。Rox-Behnken開展響應面的優化試驗。②風味蛋白酶：酶濃度X1、反應時間X2是影響自由基清除率的主要因素，將其作為自變量;自由基清除率Y1、Y2、Y3作為因變量，在專業軟件的協助下開展響應面優化試驗。

超濾分級分離：應用截留分子量依次是5000、3000、10000u超濾膜分別對小麥混合肽進行分級分離處理，獲得I、II、III、IV組分，均進行冷凍干燥處理以備用。用以上四組分與混合肽試樣配制3mg/mL，測定DPPH、O2-、·OH清除率。

3. 統計與分析結果

3.1 堿性蛋白酶

3.1.1 酶解結果

當底物質量分數<10%時，伴隨底物質量分數的增加，蛋白酶解物的DPPH、O2-、·OH清除率均呈提高趨勢;質量分數恰好是10%時，以上三種自由基的清除能力均達到峰值，依次是56.32%、55.68%、58.45%;質量分數>10%時，三種自由基的清除能力均呈下滑趨勢。當添加的酶和底物充分反應后，再增加底物濃度使其處于飽和狀態，對底物與酶兩者的反應起到一定抑制作用。綜合認為，底物質量分數是10%時，堿性蛋白酶的自由基清除能力達到最佳。

酶含量<2000U/g時，3種自由基清除能力高低和酶濃度大小之間呈正比關系;酶含量是2000U/g時，，各自由基清除能力均達到峰值;>2000U/g，各自由基清除能力均穩定降低。酶添加量過多，容易造成酶之間形成較強的競爭關系，對蛋白酶解過程會形成一定抑制作用。結合本試驗結果，酶含量是2000U/g時，蛋白酶解物清除自由基的能力最佳。

伴隨酶解時間的延長，三種自由基的清除能力均有提高，持續酶解4h后自由基的清除能力趨于穩定且稍降低。4h內反應快速，小麥蛋白和酶結合成分，生成大量的小麥多肽，這是提升自由基清除率的重要基礎。反應時間過長不僅容易造成小麥多肽過早氧化，也可能提高生產成本，選擇酶解的最佳酶解時間4h。

3.1.2 酶解響應面試驗

回歸擬合試驗所得數據，獲得響應面回歸方程。分析回歸方差發現，基于實驗各指標建設的二次回歸模型之間形成了顯著差異（P<0.01），各Y1、Y2、Y3響應值的失擬項依次是0.437、0.144、0.183，都在0.05以上，提示模型和實際數據擬合較好，回歸方程位失擬。利用變異系數（CV）表示實驗自身的精準性，本試驗各響應值的CV值依次為4.06%、4.86%、3.77%，CV值偏小，代表試驗的可靠性較高。通過分析發現，酶濃度對以上三種自由基清除效果形成的影響最大。當酶濃度恒定時，伴隨底物濃度的增加，各自由基清除率均表現出先升后降的變化趨勢，但下降趨勢并不顯著。觀察等高線圖，底物質量分數11-12%，酶含量2000-300U/g，優化三種自由基清除率能得到峰值。

第1步酶解最佳工藝參數：底物內堿性蛋白酶的含量11.3%，酶含量、pH對應值分別是2210U/g、8.4，55℃溫度條件下持續酶解4.4h;預估DPPH、O2-、·OH清除率分別為60.26%、58.85%、60.06%。

3.2 風味蛋白酶

3.2.1酶解試驗結果

風味蛋白酶添加量1000U/g時，對自由基清除效果最佳，此時測得DPPH、O2-、·OH清除率依次是71.23%、68.32%、72.07%。酶解適宜時間2h，以上三種自由基清除率76.58%、74.12%、77.86%。

3.2.2響應面試驗

結合方差計算結果，利用各指標建設的二次回歸模型，其間存在十分顯著的差異（P<0.01），各響應值的失擬項均>0.05，提示本模型和實際數據之間形成了良好的擬合關系，可采用該回歸方程分析試驗結果。校正系數依次是0.898，、0.944、0.932，提示運用該模式能依次解釋89.8%、94.4%、93.2%的響應值改變。本試驗各響應值的變異系數（CV）分別是3.1%、1.98%、2.51%，CV值較低，提示試驗可靠性較高。可采用這種模型分析與預測小麥蛋白酶解第2步，Design-Expert V8.0.6軟件模擬優化回歸方程，得出最佳工藝參數：pH、溫度分別為1075U/g、6.6、50℃時酶解處理風味蛋白酶2.3h，自由基DPPH、O2-、·OH清除率分別75.37%、74.52%、76.28%。

結束語

應用堿性及風味蛋白酶分步酶解法酶解處理小麥蛋白，能成功制備出高抗氧化性小麥肽，分別獲得第1、2步最佳工藝參數，最后測得自由基DPPH、O2-、·OH清除率分別75.37%、74.52%、76.28%。

作者簡介：

劉世欣（1988.4-），女，河南安陽人，本科，研究方向：淀粉糖品控。