經皮穴位電刺激對行腹部手術老年大鼠的腦保護作用及機制▲

譚素紅 梅習平 丁惠娟 李 媛

(1 湖南省人民醫院麻醉醫學中心，長沙市 410002，電子郵箱：mge2345@163.com；2 湖南省腫瘤醫院/中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院麻醉科，長沙市 410002)

術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)多發于急診手術或大手術后的老年患者，是術后臨床常見的中樞神經系統并發癥，表現為意識紊亂、焦慮、人格改變、注意力及記憶力減退等，影響患者術后的生活質量。POCD與年齡、手術、麻醉等多種因素有關，且幾乎所有POCD的發生都與年齡相關[1]。老年人中樞神經功能減退，手術創傷極易損傷神經系統，導致POCD發生。近年來，手術操作和麻醉技術的進步，在一定程度上緩解了POCD的發生，但隨著人口老齡化發展，接受手術治療的老年患者比例不斷增加，POCD發生率仍居高不下，因此尋找有效方法保護老年患者的腦神經至關重要。經皮穴位電刺激(transcutaneous electrical acupoint stimulation，TEAS)療法是一種新型物理治療方法，其將電神經療法與中醫針灸穴位相結合，并以中醫經絡腧穴理論為指導，通過穴位將低頻脈沖電流輸入，在進行穴位刺激的同時施行低頻電療，以達到治療疾病的目的[2]。研究顯示，TEAS與傳統針灸功能相似，具有平衡麻醉的作用，并在腦卒中等神經性疾病中有明顯的輔助或替代治療的效果[3-4]。但TEAS對POCD患者的腦保護作用及可能機制的相關研究較少，本研究通過建立POCD大鼠模型，探討TEAS的腦保護作用及其可能機制，旨在為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠，雄性，45只，18月齡，體質量500～650 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0006]提供，均無明顯運動障礙。于溫度為21℃～25℃、相對濕度為50%～70%、12 h明暗交替、清潔通風的環境中適應性飼養7 d，動物自由采食飲水。

1.2 主要試劑和儀器 石杉堿甲片(國藥準字H20093133，規格：0.05 mg×24 s)購自辰欣藥業股份有限公司，脫氧核苷酸末端轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)凋亡染色試劑盒(批號：C1091)購自碧云天生物工程有限公司，RIPA裂解液(批號：R0020-100)購自北京索萊寶科技有限公司，腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)α多抗(批號：ab110036)、磷酸化AMPKα(phosphorylated AMPKα,p-AMPKα)單抗(批號：ab133448)、Beclin1單抗(批號：ab210498)、液泡分選蛋白34(vacuolar protein sorting 34，Vps34)單抗(批號：ab240006)、β-肌動蛋白(β-actin)單抗(批號：ab8226)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(批號：ab6721)購自美國Abcam公司、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)多抗(包含LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ 兩種抗體；批號：VB2932)購自英國Viva Bioscience公司。韓氏穴位神經刺激儀購自北京華衛產業開發公司，Morris水迷宮系統購自安徽正華生物儀器設備有限公司，H-7500透射電子顯微鏡購自日本Hitachi Limited公司，垂直電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 建模、分組及干預：采用隨機數字表法抽取35只大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg，溶于5 mL生理鹽水)進行麻醉，固定于手術臺上，腹部備皮消毒，鋪手術巾，于上腹部腹正中線作一約5 cm的切口，鈍性分離肌肉，暴露腹膜，剪開后使用探查針依次探查肝、脾、胃、小腸和大腸，約2 min；還納腸管，游離脾臟至術野中央，用1號絲線將脾門血管雙重結扎，行脾切除術(如有副脾，需一并切除)，3-0號線縫合傷口，使用0.25%丁哌卡因浸潤傷口鎮痛。術后腹腔注射青霉素40萬U，1次/d，連續3 d，單籠飼養。選取術后24 h無行動障礙的30只大鼠進行后續實驗，采用隨機數字表法分為手術組、TEAS組、西藥組，每組各10只。另取10只大鼠為對照組，腹腔注射5 mL生理鹽水，不行腹部手術。術后24 h進行干預。(1)TEAS組。固定大鼠，根據《實驗針灸學》[5]，選取頭頂百會、神庭和兩前肢內關、合谷和后肢三陰交、足三里，給予TEAS，頻率15 Hz，強度10 mA，共刺激30 min，同時灌胃5 mL生理鹽水。(2)對照組和手術組。為確保實驗條件一致，兩組均給予假穴位電刺激(避開特定穴位，即穴位右側1 cm處)，頻率15 Hz，強度10 mA，刺激30 min，并灌胃5 mL生理鹽水。(3)西藥組。固定大鼠，給予假穴位電刺激(避開特定穴位，即穴位右側1 cm處)，刺激頻率、強度和時間同TEAS組，同時灌胃石杉堿(溶于5 mL生理鹽水)3 mg/kg。各組干預均1次/d，連續1周。

1.3.2 Morris水迷宮實驗：末次治療后12 h，進行水迷宮實驗檢測大鼠的學習記憶能力。水迷宮系統包括水池和錄像系統，水池直徑150 cm，高30 cm，水溫23℃～25℃，分為4個象限(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，每個象限設有固定入水點，Ⅳ象限水面下2 cm處設一平臺(直徑10 cm)。(1)定位航行試驗。將大鼠隨機從4個入水點放入水中，觀察大鼠找到水下平臺所需時間，即逃避潛伏期，如120 s內找不到平臺，則引導其到平臺停留30 s，每天進行3次訓練，連續訓練5 d，記錄第6天各組大鼠的逃避潛伏期。(2)空間探索實驗。第6天撤去平臺，記錄大鼠入水找到原平臺象限后的停留時間及穿越原平臺次數。

1.3.3 曠場實驗：水迷宮實驗結束后，進行曠場實驗檢測大鼠行為學。曠場箱底部為50 cm×50 cm的正方形，高40 cm，上方安裝攝像頭，底部劃分為25個相等的正方形。將大鼠放入曠場中央，檢測5 min內大鼠水平運動得分(以跨過方格次數計分，跨過1格為1分)和垂直運動得分(以站立次數計分，站立1次為1分)。每只大鼠測試完畢后使用70%乙醇擦拭曠場四周和底部，以免大鼠氣味影響后續實驗的大鼠。

1.3.4 蘇木精-伊紅染色觀察腦組織病理變化：曠場實驗結束后，采用隨機數字表法，各組抽取5只大鼠，開胸，暴露心臟，行左心室-升主動脈灌注，先用預溫生理鹽水灌注，待右心房流出清澈液體，改用4%多聚甲醛灌注，待大鼠出現四肢抽搐，全身僵硬，停止灌注。取腦，分離海馬，固定于4%多聚甲醛中。乙醇脫水，二甲苯透明，制作石蠟切片(厚約4 μm)，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，光學顯微鏡下觀察海馬組織病理學變化。

1.3.5 TUNEL染色觀察神經元細胞凋亡：取石蠟片，二甲苯脫蠟，乙醇脫水，蛋白酶K 37℃作用30 min，磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，滴加TUNEL檢測液37℃避光孵育60 min，磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，封片，顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，棕色的細胞為凋亡細胞，每張切片于400倍鏡下計數5個視野的凋亡細胞數，計算凋亡率(%)=凋亡細胞數/細胞總數×100%，取均值。

1.3.6 透射電鏡觀察海馬組織自噬情況：處死各組剩余大鼠，取腦分離海馬組織，部分海馬組織保存于液氮中，剩余海馬用磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mmol/L)清洗3次，2.5%戊二醛固定2 h，1%四氧化鋨固定2 h，磷酸鹽緩沖溶液清洗3次，常規乙醇、丙醇梯度脫水，環氧樹脂浸透、包埋，制備切片(厚度約0.5 μm)，光鏡下定位海馬區，制備60 μm超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，透視電鏡(日本日立公司，型號：H-7500)下觀察并拍照。

1.3.7 蛋白免疫組化法檢測海馬組織相關蛋白表達：取保存于液氮的海馬組織，加入RIPA裂解液提取總蛋白，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。取等量蛋白上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白電轉至聚偏氟乙烯膜，放入5%脫脂牛奶中4℃封閉2 h，TBST溶液洗膜，加入1 ∶1 000稀釋的AMPKα、p-AMPKα、Beclin1、Vps34、LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ、β-actin一抗，4℃孵育過夜，TBST溶液洗膜，加入1 ∶4 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，常溫孵育2 h，加入ECL發光液，顯影曝光。采用Image J 軟件分析圖像，以β-actin為內參，計算目的蛋白相對表達量(即目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值)，并計算LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ蛋白相對表達量的比值(即LC3-Ⅱ蛋白相對表達量/LC3-Ⅰ蛋白相對表達量)。

1.4 統計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠學習記憶能力指標的比較 4組的逃避潛伏期、原平臺象限停留時間、穿越平臺次數比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。與對照組比較，手術組、TEAS組、西藥組逃避潛伏期延長，原平臺象限停留時間縮短，穿越平臺次數減少(均P<0.05)；與手術組比較，TEAS組、西藥組逃避潛伏期縮短，原平臺象限停留時間延長，穿越平臺次數增加(均P<0.05)；但TEAS組與西藥組以上指標比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 4組大鼠學習記憶能力指標的比較(x±s)

2.2 各組大鼠行為學指標的比較 4組的水平運動得分和垂直運動得分差異均有統計學意義(均P<0.05)。與對照組比較，手術組、TEAS組、西藥組水平運動得分、垂直運動得分均減少(均P<0.05)；與手術組比較，TEAS組、西藥組水平運動得分、垂直運動得分均增加(均P<0.05)；TEAS組與西藥組水平運動得分、垂直運動得分差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 4組大鼠行為學指標的比較(x±s，分)

2.3 各組海馬組織病理學變化 顯微鏡下觀察，對照組大鼠海馬組織神經元細胞形態正常，排列整齊，大小及核染色均勻；手術組海馬組織神經元細胞形態改變，核固縮，部分細胞出現壞死；TEAS組和西藥組海馬組織神經元細胞形態較正常，核固縮減少，壞死細胞減少，較手術組改善明顯。見圖1。

圖1 海馬組織病理學變化(HE染色，×400)

2.4 各組海馬神經元細胞凋亡率的比較 各組海馬神經元細胞凋亡率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，手術組、TEAS組、西藥組神經元細胞凋亡率升高(P<0.05)；與手術組比較，TEAS組、西藥組神經元細胞凋亡率降低(P<0.05)；TEAS組與西藥組神經元細胞凋亡率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3和圖2。

表3 4組大鼠海馬神經元細胞凋亡率的比較(x±s，%)

圖2 4組海馬組織神經元細胞凋亡情況(TUNEL染色，×400)

2.5 各組海馬組織的自噬情況 透射電鏡下可見對照組海馬組織自噬體較少，手術組自噬體明顯增加，而TEAS組和西藥組自噬體較手術組減少。見圖3。

2.6 各組自噬相關蛋白相對表達量的比較 4組海馬組織p-AMPKα、Beclin1、Vps34、蛋白相對表達量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)，手術組、TEAS組、西藥組p-AMPKα、Beclin1、Vps34蛋白相對表達量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均高于對照組(均P<0.05)；與手術組比較，TEAS組、西藥組以上指標均降低(均P<0.05)，但TEAS組與西藥組之間差異無統計學意義(P>0.05)。4組的AMPKα蛋白相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見表4和圖4。

圖3 海馬組織自噬情況(透射電鏡，×10 000)

表4 4組自噬相關蛋白相對表達量的比較(x±s)

圖4 4組自噬相關蛋白表達情況

3 討 論

手術應激是導致老年人發生POCD的主要危險因素之一，加之老年人神經細胞數量減少、腦氧代謝率下降、腦功能減退，常伴隨出現神經癥狀，因此易發生POCD[6]。手術相關的機械性損傷、炎癥、心理應激等可造成神經元變性，甚至引起壞死或凋亡，導致認知功能受損[7]。有動物實驗顯示，老年大鼠行腹部手術后出現的認知能力下降和行為學改變與手術應激有關[8]。本研究的水迷宮實驗和曠場實驗結果均證實，老年大鼠行腹部手術后出現認知功能障礙，行為學發生異常改變。海馬與學習、記憶和情感等高級認知功能密切相關，術后應激可導致海馬結構發生變化，引起認知功能障礙[9]。本研究中，手術組海馬組織神經元細胞形態發生改變，海馬組織神經元凋亡明顯。

TEAS以傳統中醫經絡理論為指導，使用不同頻率電流刺激，通過經絡、腧穴傳導效應，改善和消除疾病癥狀。TEAS無痛無創，鎮痛效果良好，臨床廣泛應用于慢性疼痛、癌痛鎮痛以及輔助麻醉，療效顯著[10-11]。研究表明，TEAS可明顯改善七氟醚全麻患者術后出現的嗅覺記憶障礙[12]。此外，穴位刺激可影響腦電變化，激活腦功能區[13]。動物實驗研究表明，刺激特定穴位，可不同程度地改善腦缺血再灌注引起的海馬神經元凋亡，發揮神經保護作用[14]。頭為諸陽之會，百脈之宗，百會穴位于頭頂正中，為督脈要穴，與腦緊密相連，神庭穴屬督脈經穴，足太陽，足陽明之會，刺激百會、神庭可開竅醒腦、安神定志，增強神經功能；內關、合谷與三陰交、足三里4穴位陰陽相配，具有健腦醒神、疏經活絡之功。本研究使用TEAS干預行腹部手術的老年大鼠的以上穴位，結果顯示，大鼠的學習記憶能力和行為學指標、海馬組織神經元細胞形態均有改善，海馬組織神經元凋亡減少，且效果與臨床常用西藥的效果相當，提示TEAS可逆轉POCD引起的神經元結構變化，提高學習記憶功能，發揮腦保護作用。

自噬是細胞的一種自我消化過程，在維持神經元細胞正常生理功能方面具有重要作用：一方面，自噬可使細胞免于凋亡，維持存活；另一方面，自噬也可促進細胞死亡[15-16]。自噬和細胞凋亡相互作用，共同影響生物體發育和組織內穩態。本研究透射電鏡觀察顯示，手術組海馬組織自噬體較對照組明顯增多，經TEAS治療后，自噬體明顯減少，這提示POCD過程中自噬激活，而TEAS可抑制自噬，減少神經元凋亡，保護神經。自噬發生過程復雜，受多個信號通路共同調控，其中AMPK通路是自噬的重要調控途徑之一[17]。AMPK通路與細胞生存和死亡過程關系密切，AMPK磷酸化活化后，參與自噬過程[18]。Beclin1蛋白在自噬調控中發揮核心作用，參與調節自噬起始階段，游離Beclin1可與Vps34結合，在自噬激活及亞細胞膜定位過程中發揮關鍵作用[19]。應激情況下，游離Beclin1增加，與Vps34結合形成Beclin1-Vps34復合體，激活自噬[20]。LC3蛋白合成后C端被酶切生成LC3-Ⅰ蛋白，自噬發生后，LC3-Ⅰ蛋白被修飾而形成LC3-Ⅱ蛋白，從而參與自噬形成，是自噬發生的標志性蛋白[21]。本研究蛋白免疫印跡實驗結果顯示，手術組AMPK通路被磷酸化激活，同時Beclin1、Vps34、LC3-Ⅱ表達增加，表明POCD過程伴隨自噬激活。自噬在神經系統疾病中發揮重要作用，刺激特定穴位可通過細胞自噬途徑來改善神經元損傷[22]。研究顯示，TEAS可有效緩解大鼠超負荷訓練引起的心肌細胞凋亡和自噬，減輕心臟重塑[23]。體外實驗研究表明，適當頻率的電刺激可促進巨噬細胞自噬而發揮抗炎和抗化膿作用[24]。TEAS采用電療結合穴位經絡，可增強機體防御能力，促進功能恢復。本研究結果顯示，經TEAS治療后，大鼠海馬組織p-AMPK、Beclin1、Vps34、LC3-Ⅱ蛋白表達明顯減少，提示TEAS可能是通過抑制AMPK信號通路來抑制自噬，減少神經元細胞凋亡，保護腦神經。

綜上所述，AMPK信號通路活化參與POCD過程中自噬的激活，TEAS治療可改善POCD大鼠認知功能和異常行為，減少神經元細胞凋亡，且干預效果與常用西藥相似，其作用機制可能與抑制AMPK信號通路激活的自噬途徑有關。