富硒靈芝對妊娠期糖尿病大鼠脂代謝的調節作用*

黃晶 柏青 華蕾 張思成 何飛敏 徐小瓊

(云南省第三人民醫院產科，云南 昆明 650100)

妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus,GDM)是孕婦常見的并發癥之一，發生率約為3%～5%，可給孕婦及胎兒帶來一定損害，因此需積極關注[1-3]。靈芝是我國古典用藥的上品藥物，其性溫，味淡適合于多種疾病的輔助治療[4]。研究發現，孕婦也可以安全服用靈芝，其藥理作用主要為松弛子宮肌肉，避免肌肉的過度收縮，進而起到安胎的效果，此外其還可以補充多種微量元素，促進胎兒的生長和發育[5-6]。富硒靈芝是人工培育的靈芝品種，其有機硒含量明顯高于普通靈芝，武俊紫等[7]研究報道，富硒靈芝對非酒精性脂肪肝病具有明顯的效果，其作用機理與富硒靈芝可以改善脂代謝相關基因表達有關。本研究推測其可能對GDM脂代謝水平也有一定的作用。為此本研究擬構建GDM大鼠模型，采用富硒靈芝治療，觀察脂代謝調節相關基因固醇原件調節蛋白-1c(sterol regulatory binding proteins-1c,SREBP-1c)、乙酰輔酶A羧化酶α (acetyl coenzyme A carboxylase α，ACCα)、硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)和過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptorα，PPARα)的表達變化特點，為富硒靈芝可以安全用于孕婦提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠100只，其中20只雄性，80只雌性，購于昆明醫科大學動物實驗中心，動物合格證號：SYXK(滇)K2015-0002。購買后分籠飼養，飼養于標準動物飼養間，溫度22～26 ℃，濕度40%～60%，日常采用光照采光，光照周期為12 h。本實驗對動物的處理符合動物倫理要求，并經醫院倫理委員會審核、批準。

1.2 試驗藥物和試劑 富硒靈芝(沈陽康硒生物科技有限公司,含硒量3.162 mg/kg)；鹽酸二甲雙胍緩釋片(正大天晴藥業集團股份有限公司,國藥準字H20031104)；戊巴比妥鈉(上海信裕生物科技有限公司)；鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)購于美國sigma公司；大鼠天門冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、總膽固醇(Total Cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(High density liptein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(Low density liptein cholesterol,LDL-C)購于南京建成生物工程研究所；SREBP-1c、ACCα、SCD1和PPARα、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體和DAB顯色試劑盒購于美國Santa Cruz公司；二抗購于北京中杉金橋生物公司；引物由上海生物生工設計并生產。

1.3 主要儀器 V-5800紫外-可見光分光光度計(上海元析儀器有限公司)；安穩+型血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)；CKX53型熒光倒置顯微鏡 (Olympus中國有限公司)；S-1-150S型臺式低溫高速離心機(鞏義市宏華儀器設備工貿有限公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell型蛋白電泳系統(美國伯樂公司)；Gentier 48E 型QT-PCR儀(西安天隆科技有限公司)。

1.4 GDM大鼠模型的制備及分組 本研究模型的制備參照楊麗等[8]文獻報道方法。所有雄鼠全程只給予普通飼料，雌性大鼠購買后先適應性喂養1周(普通飼料+日常自來水飲用)，后隨機選取12只作為正常組(普通飼料+日常自來水飲用)，其余68只則給予高脂飼料喂養8周(高脂飼料喂養+日常自來水飲用，高脂飼料配方為：83.25%基礎飼料、10%豬油、5%蔗糖、1.5%膽固醇和0.25%膽酸鈉)。高脂飼料喂養8周后，將雄性大鼠和雌性大鼠按照1∶4同籠過夜，次日通過鏡檢檢查是否懷孕，當陰道發現有精子存在的確定懷孕。確定懷孕后所有高脂飼料喂養的大鼠給予腹腔一次性注射STZ 35mg/kg,注射3 d后檢測血糖，血糖值穩定于13.0 mmol/L時確定GDM大鼠造模成功(連續三天空腹血糖值均超過13.0 mmol/L)。造模成功后，將大鼠按照隨機數字法分為模型組、鹽酸二甲雙胍組、富硒靈芝(低、中和高劑量)組，每組各12只。所有大鼠均給予藥物干預2周，其中正常組和模型組給予生理鹽水3 mL/d灌胃，鹽酸二甲雙胍組給予鹽酸二甲雙胍200 mg/kg·d灌胃，富硒靈芝低、中和高劑量組給予富硒靈芝水(1、2和4 g富硒靈芝用20 mL水煮沸30 min,最后蒸發濃縮為3 mL分別給予低、中和高劑量組大鼠)灌胃(給藥劑量根據大鼠和人體換算公式得到，沈陽康硒生物科技有限公司建議正常人一天可服用富硒靈芝25 g,根據換算公式，大鼠用藥劑量=人體用藥劑量/12×100%，得到大鼠劑量為2 g左右，所以設置中劑量組為2 g,低劑量組為中劑量組的一半，高劑量組為中劑量組的一倍)，2周后進行后續實驗。

1.5 空腹血糖水平檢測 分別于治療0、7 d和處死前采用尾靜脈取血法收集大鼠血糖，檢測血糖變化特點。

1.6 血脂水平和肝功能檢測 所有大鼠分批次禁食不禁水12 h,次日采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈取血法收集血液，血液收集后離心，離心條件為3000 r/min 離心10 min,離心半徑6 cm,離心后收集上清，根據試劑盒提供的說明書，采用分光光度計檢測血脂TC、TG、LDL-C和HDL-C,肝功能AST和ALT 的含量。

1.7 酶聯免疫印跡法(Elisa)檢測肝脂水平 取出肝臟組織，稱取1 g置入組織裂解液中，采用電動研磨器研磨后，低溫高速離心機3000 r/min 離心10 min,離心半徑6 cm,離心后取出上清，采用試劑盒提供的說明書檢測血脂TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量變化。

1.8 蘇木精-伊紅(HE)染色法檢測肝臟組織病理學 獲得肝臟后，統一將肝左葉置入4%的中性福爾馬林溶液中浸泡24～72 h,后分批次取出，采用生理鹽水洗滌，石蠟包埋，切片，常規HE染色即完成，完成后采用中性樹脂封片，熒光倒置顯微鏡采集圖像。

1.9 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測相關蛋白表達 稱取1 g肝臟組織，將其研磨后，低溫高速離心機3000 r/min 離心 10 min,離心半徑6 cm,完成后采用BCA法對其進行定量并調平，然后每組各取50 μg行SDS-PAGE 電泳，電泳完成后將目的蛋白裁剪后轉移到PVDF膜，45 min后取出，洗滌后將其采用牛血清蛋白封閉2 h,后加入一抗(SREBP-1c、ACCα、SCD1和PPARα)封閉過夜，次日取出后加入二抗封閉30 min后，暗室曝光洗片，掃描儀掃描后采用Image J計算各條帶灰度值，每組實驗重復3次。結果以對應條帶的灰度值/GAPDH灰度值分析。

2 結果

2.1 肝臟切片的病理學變化 HE染色結果顯示，正常組肝細胞清晰可見，紋理清晰，沒有明顯病理學變化，而模型組則出現典型的脂肪顆粒浸潤，呈空泡樣改變。與模型組相比，各治療組均有一定的好轉。此外從切片中可簡單看出，富硒靈芝中、高劑量組明顯好于鹽酸二甲雙胍組。見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟組織HE染色圖(200×)Figure 1 HE staining of liver tissue of rats in each group注：圖中A、B、C、D、E和F分別為正常組、模型組、鹽酸二甲雙胍組、富硒靈芝低劑量組、富硒靈芝中劑量組和富硒靈芝高劑量組

2.2 各組大鼠肝功能 AST 及 ALT比較 與正常組相比，模型組AST和ALT明顯升高 (P<0.05)；與模型組相比，富硒靈芝組和鹽酸二甲雙胍組均明顯降低 (P<0.05)，且富硒靈芝中、高劑量組明顯低于鹽酸二甲雙胍組 (P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肝功能指標比較Table 1 The comparison of liver function indexes of rats in each group

2.3 肝脂和血脂的變化特點 與正常組相比，模型組大鼠血清和肝臟組織中TC、TG和LDL-C含量均明顯升高 (P<0.05)，HDL-C明顯降低 (P<0.05)；與模型組比較，各治療組TC、TG和LDL-C含量均明顯降低 (P<0.05)，而HDL-C則明顯升高 (P<0.05)；與鹽酸二甲雙胍組比較，富硒靈芝中、高劑量組TC、TG和LDL-C 均明顯降低 (P<0.05)，HDL-C明顯升高 (P<0.05)，見表2、表3。

表2 各組大鼠血脂指標比較Table 2 The comparison of blood lipid indexes of rats in each group

表3 各組大鼠肝脂指標比較Table 3 The comparison of liver lipid indexes of rats in each group

2.4 各組大鼠血糖變化比較 與正常組相比，模型組血糖在三個時間段均明顯升高 (P<0.05)；與模型組相比，在治療1周和2周后，鹽酸二甲雙胍組血糖明顯降低 (P<0.05)，但富硒靈芝三個組在第0天和7天均沒有明顯變化，治療第14天，富硒靈芝高劑量組低于模型組 (P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠血糖比較Table 4 The comparison of blood glucose of rats in each group

2.5 脂代謝基因蛋白表達特點 與正常組相比，模型組大鼠肝臟組織中SREBF-1c及ACCα蛋白表達均明顯升高 (P<0.05)，SCD1和PPARα均明顯降低 (P<0.05)；與模型組相比，各治療組均有一定改善(P<0.05)；與鹽酸二甲雙胍組相比，富硒靈芝三個劑量組SREBF-1c表達無明顯差異(P>0.05)，PPARα表達明顯升高 (P<0.05)，富硒靈芝中劑量和高劑量組ACCα蛋白表達明顯降低 (P<0.05)，SCD1明顯升高 (P<0.05)，見表5、圖2。

圖2 各組大鼠肝臟組織SREBF-1c、ACCα、SCD1和PPARα蛋白表達Figure 2 The protein expression results of SREBF-1c,ACCα,SCD1 and PPARα in liver tissues of rats in each group注：圖中A、B、C、D、E和F分別為正常組、模型組、鹽酸二甲雙胍組、富硒靈芝低劑量組、富硒靈芝中劑量組和富硒靈芝高劑量組

表5 各組大鼠肝臟組織SREBF-1c、ACCα、SCD1和PPARα的相對表達量Table 5 The protein relative expression of SREBF1,ACCα,SCD and PPARα in liver tissues of rats in each group

3 討論

現代醫學研究表明，血脂代謝失調或高脂食物的過度攝入是孕婦發生糖尿病的原因之一，而血脂的有效調控對孕婦的預后較好[9-10]。血脂異常與肝臟脂代謝密切相關，研究發現[11]肝臟是調節脂代謝的核心器官，因此GDM患者應重視肝功能和血脂的變化。但孕婦用藥過失可給患者自身和胎兒帶來一定的損害。目前臨床中對于GDM的治療主要以飲食調節+注射胰島素或口服降糖藥物為主[12-13]，但其仍可產生一定副作用，且胰島素或口服降糖藥物對血脂調控較差。中醫藥在調控血脂方面也具有一定的優勢，作為中醫藥瑰寶之一，靈芝在改善肝功能、降低血脂方面有較多文獻報道，而富硒靈芝相對于靈芝而言，藥理活性相對更高[14-15]，其對GDM是否也有一定的作用還缺少研究證實，為此本研究開展了上述研究。

AST和ALT是評價肝功能變化的核心指標。對于正常人，血清中AST和ALT含量較低，而GDM特別是肥胖型GDM患者，肝臟中堆積有大量脂肪顆粒，這些脂肪顆粒可擠壓肝臟細胞，進而造成肝臟中AST和ALT過量分泌，最終造成血清中AST和ALT的升高[16]。本研究顯示，與正常組相比，模型組大鼠血清中AST和ALT明顯升高，而富硒靈芝可明顯的降低二者含量，這提示富硒靈芝對GDM大鼠肝臟具有明顯的保護作用，與陳利明等[15]研究結果相似。富硒靈芝可有效改善肝功能。脂肪肝發生后，血脂四項可表現為TG、TC和LDL-C的升高和HDL-C的降低，這些指標如果長期異常，對于孕婦自身而言，可引起動脈硬化、心肌梗死等，而對于胎兒而言，可造成巨大兒的發生，甚至可提高胎兒成年后多種代謝性疾病的發生率[17-19]，因此需積極關注孕婦血脂變化。本研究發現，與正常組相比，模型組TG、TC和LDL-C明顯升高，HDL-C明顯降低，富硒靈芝和鹽酸二甲雙胍均可以明顯降低TG、TC和LDL-C含量，升高HDL-C,且富硒靈芝中、高劑量組效果明顯好于鹽酸二甲雙胍組，表明富硒靈芝對妊娠期糖尿病大鼠血脂代謝具有明顯的調節作用。

脂代謝的發生是一個復雜的過程，目前主要有兩種方式，一種為α氧化，另一種為β-氧化，其中α氧化主要是脂肪酸合成的關鍵信號通路，主要作用為將攝入的糖類合成脂肪，而β-氧化主要是脂肪酸分解的重要信號通路，主要作用為促進脂肪酸的分解代謝[20-22]。在脂肪酸α氧化過程中SREBP-1c是合成的起始酶，其表達的升高直接影響肝臟中脂肪酸合成量的高低[23]。而脂肪酸β-氧化的主要蛋白酶有三個，分別為ACCα、SCD1 和 PPARα，其中ACCα是脂肪酸β-氧化的限速酶，PPARα和SCD1是脂肪酸ββ氧化的促進酶，在脂肪酸β-氧化過程中，ACCα表達的升高和PPARα和SCD1表達的降低，可造成脂肪酸分解的降低，反之亦然[24]。為此本研究從脂肪酸氧化途徑觀察富硒靈芝對GDM大鼠血脂調控的作用，研究結果發現，與正常組相比，模型組大鼠肝臟組織中SREBF-1c及 ACCα 蛋白表達明顯升高，SCD1和PPARα表達明顯降低，富硒靈芝和鹽酸二甲雙胍均可以有效的降低SREBF-1c及 ACCα表達，升高SCD1和PPARα，這提示富硒靈芝對調節脂代謝具有明顯的作用。同時結果也可以看出，富硒靈芝相較于鹽酸二甲雙胍，主要優勢是在調控脂肪酸β-氧化方面，提示富硒靈芝改善脂肪酸代謝，特別是改善脂肪酸β-氧化方面具有較好的優勢，其降低血脂也可能是通過調節脂肪酸β-氧化實現的。

4 結論

富硒靈芝對妊娠期糖尿病大鼠脂肪酸代謝具有明顯的調控作用，其可通過調節脂肪酸α氧化和β-氧化相關蛋白酶，特別是調節β-氧化相關蛋白酶，進而降低血脂，改善肝功能，最終保護肝臟。本研究結果對今后妊娠期糖尿病患者的輔助治療具有重要的啟迪意義。