黃芩苷對人牙周膜干細胞生物學特性的影響及作用機制

黃瓊 李婧 李長宏

(1.西寧市口腔醫院牙周科，青海 西寧 810000；2.青海大學附屬醫院口腔頜面外科，青海 西寧 810000)

牙周病是指發生在牙周組織的疾病，也是導致成年人牙齒脫落的主要原因之一。包括牙齦炎和牙周炎在內的牙周疾病影響全世界多達90%的人[1]。牙周膜內的多能干細胞即牙周膜干細胞(Periodontal Ligament Stem Cells,PDLSCs)已被認為是牙周組織修復和再生的理想細胞來源[2]。PDLSCs在體外誘導培養條件下顯示出成骨、成脂和成軟骨的特性。此外，PDLSCs移植療法在動物模型受損的牙周組織中具有促進新骨，新牙骨質和功能性牙周膜形成的潛力[3-4]。盡管有這種潛力，但受損的牙周組織中所含的干細胞相對較少，要獲得足夠數量的干細胞用于移植，就需要有效的分離和體外擴增。并且，干細胞必須遷移到缺損區域并分化為適當的功能表型，以參與傷口愈合、組織修復和再生[5]。因此，有效促進PDLSCs的增殖和成骨作用對牙周組織、牙齦和牙槽骨的再生和重塑具有至關重要的作用。黃芩苷是一種黃酮類化合物，是從傳統中藥黃芩的根中分離的有效活性成分，具有廣泛的藥理學功能，如抑菌、抗炎、抗腫瘤和抗變態反應等[6-7]。以往研究顯示，黃芩苷能夠通過抑制人牙周膜細胞的炎癥反應發揮抗牙周炎的作用[8]。然而，其對PDLSCs是否存在影響及可能的機制鮮有報道。因此，本研究旨在探究黃芩苷對PDLSCs生物學特性的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 人牙周膜干細胞(PDLSCs)購于美國菌種保藏中心ATCC;黃芩苷購于中國藥品生物制品檢定所；DMEM培養基購于美國Gibco公司；青-鏈霉素雙抗、胎牛血清、胰蛋白酶購于武漢博士德生物工程有限公司；Wnt/β-catenin信號通路特異性抑制劑XAV939購于美國Prospec公司；細胞計數法(CCK-8)檢測試劑購于日本同仁化學研究所；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測試劑盒購于賽默飛世爾科技有限公司；Transwell小室購于美國BD公司；引物購于上海生工生物工程股份有限公司；β-catenin、Cyclin D1和c-myc單克隆抗體購于美國CST公司；HRP標記的IgG二抗購于美國Santa Cruz公司；蛋白免疫印跡(Western blot)相關檢測試劑購于上海碧云天生物技術研究所。本研究經西寧市口腔醫院倫理委員會審核、同意。

1.2 細胞培養和分組 將凍存的PDLSCs從液氮中取出，融化復蘇后接種到細胞培養瓶中，內含10%胎牛血清的DMEM培養基，將培養瓶放置在37 ℃培養箱，設置條件為5% CO2、飽和濕度，觀察細胞生長狀態，及時更換培養液并進行傳代，取第3代的細胞用于后續實驗。取生長狀態良好的PDLSCs種植在96孔板中，將細胞隨機分為3組：control組、baicalin組和baicalin+XAV939組。control組PDLSCs以正常DMEM培養液進行培養，baicalin組PDLSCs以濃度為1.0 μmol/L baicalin(根據前期預實驗結果篩選黃芩苷的作用濃度)的DMEM培養液進行培養，baicalin+XAV939組PDLSCs以濃度為1.0 μmol/L baicalin和4 μmol/L Wnt/β-catenin信號通路特異性抑制劑XAV939的DMEM培養液進行培養。

1.3 CCK-8檢測 對數期的PDLSCs接種到96孔板中，接種密度為2×104個/孔，待細胞貼壁后以1.2分組處理，分別在24、48和72 h時在各孔中加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃培養4 h,使用酶標儀測定450 nm波長每孔細胞的吸光度(OD)值，以OD值的高低反映PDLSCs增殖能力的大小。

1.4 黏附實驗 在6孔板中加入PBS稀釋的Fibronectin,于4 ℃靜置16 h,吸去Fibronectin,以PBS洗滌3次，再加入0.2%的BSA封閉，室溫靜置2 h,以DMEM培養液洗滌3次，備用。分組處理48 h的PDLSCs以胰蛋白酶消化，計數后稀釋呈1×103個/mL的細胞懸液，取100 μL均勻接種到6孔板中，加入相應處理的培養液，放置在37 ℃培養箱繼續培養4 h,取出后以PBS洗去未黏附的細胞，固定，計數各組PDLSCs黏附細胞數。

1.5 Transwell遷移實驗 PDLSCs以1.2分組處理48 h,胰酶消化細胞，以不含血清的培養液重懸細胞，將Transwell小室放入24孔板，上室均勻接種約1×104個細胞/孔，下室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養液，放置在37 ℃培養箱繼續培養24 h,取出小室，用棉簽除去上室殘余細胞，固定后以1%結晶紫染色，倒置顯微鏡下(隨機選取5個視野)觀察并計數遷移細胞數。

1.6 酶聯免疫檢測儀檢測堿性磷酸酶(ALP)活性 PDLSCs以1×104個/mL接種到96孔板中，生長匯合達60%時以1.2分組處理，分別在24、48和72 h按照ALP檢測試劑盒說明進行操作，采用酶聯免疫檢測儀測定ALP活性。

1.7 RT-PCR檢測 PDLSCs以1.2分組處理48 h,分別收集各組細胞，使用RNA提取試劑盒抽提總RNA,采用逆轉錄試劑盒將RNA合成cDNA,嚴格參照RT-PCR檢測試劑盒說明書進行配液和擴增。配制20 μL反應體系，反應條件為：94 ℃預變性3 min;隨后94 ℃變性30 s、60℃退火30 s、72 ℃延伸20 s,循環40次。以GAPDH為內參，使用2-ΔΔCt法計算各組PDLSC中骨鈣蛋白(OCN)、成骨細胞轉錄因子2(RUNX2)和骨橋蛋白(OPN)基因的相對表達量。使用的引物如下：OCN 上游引物：5′-TCACACTCC TCGCCCTATT-3′，下游引物：5′-GATGAGGTCAG CCAACTCG-3′；RUNX2上游引物：5′-GCAGTTCCC AAGCATTTCAT-3′，下游引物：5′-CACTCTGGCT TTGGGAAGAG-3′；OPN上游引物：5′-ATGATGGC CGAGGTGATAGT-3′，下游引物：5′-ACCATTCAA CTCCTCGCTTT-3′；GAPDH上游引物：5′-GCACC GTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGA AGCACGCCAGTGGA-3′。

1.8 Western blot實驗 收集各組處理48 h的PDLSCs,加入細胞裂解液，冰上裂解30 min,提取總蛋白，以BCA法對蛋白定量，行10%的SDS-PAGE電泳，蛋白分離后電轉至PVDF膜上，封閉，加入相應稀釋的一抗(β-catenin、Cyclin D1和c-myc一抗均為1∶500稀釋)，4 ℃過夜，次日加入1∶3000稀釋的HRP標記的IgG二抗，室溫反應2 h,滴加ECL進行顯色，以GAPDH為內參，使用Image J軟件計算各條帶灰度值。

2 結果

2.1 三組PDLSCs增殖能力比較 CCK-8實驗結果顯示，與control組相比，baicalin組PDLSCs的OD值從48 h開始明顯升高 (P<0.05)；與baicalin組相比，baicalin+XAV939組細胞OD值從48 h開始明顯降低 (P<0.05)。見圖1。

圖1 三組PDLSCs在24、48和72 h時OD值比較Figure 1 Comparison of OD values of three groups of PDLSCs at 24,48 and 72 h注：與control組相比，①P<0.05；與baicalin組相比，②P<0.05

2.2 三組PDLSCs黏附能力比較 與control組相比，baicalin組PDLSCs貼壁數明顯增加 (P<0.05)；與baicalin組相比，baicalin+XAV939組貼壁細胞數明顯降低 (P<0.05)。見圖2。

圖2 三組PDLSCs黏附能力比較Figure 2 Comparison of adhesion ability of three groups of PDLSCs注：與control組相比，①P<0.05；與baicalin組相比，②P<0.05

2.3 三組PDLSCs遷移能力比較 與control組相比，baicalin組PDLSCs遷移細胞數明顯增加 (P<0.05)；與baicalin組相比，baicalin+XAV939組遷移細胞數明顯減少 (P<0.05)。見圖3。

圖3 Transwell遷移實驗檢測三組PDLSCs遷移能力Figure 3 Transwell migration experiment detects the migration ability of three groups of PDLSCs注：與control組相比，①P<0.05；與baicalin組相比，②P<0.05

2.4 各組PDLSCs中ALP活性比較 酶聯免疫檢測儀檢測結果顯示，與control組相比，baicalin組ALP活性明顯升高 (P<0.05)；與baicalin組相比，baicalin+XAV939組ALP活性明顯降低 (P<0.05)。見圖4。

圖4 三組PDLSCs中ALP活性比較Figure 4 Comparison of ALP activity in three groups of PDLSCs注：與control組相比，①P<0.05；與baicalin組相比，②P<0.05

2.5 各組PDLSCs中OCN、RUNX2和OPN表達量比較 RT-PCR檢測結果顯示，與control組相比，baicalin組PDLSCs中OCN、RUNX2和OPN相對表達量均明顯升高 (P<0.05)；與baicalin組相比，baicalin+XAV939組PDLSCs中OCN、RUNX2和OPN相對表達量均明顯降低 (P<0.05)。見圖5。

圖5 各組PDLSCs中OCN、RUNX2和OPN相對表達量比較Figure 5 Comparison of relative expression levels of OCN,RUNX2 and OPN in each group of PDLSCs注：與control組相比，①P<0.05；與baicalin組相比，②P<0.05

2.6 各組PDLSCs中β-catenin、Cyclin D1和c-myc表達水平比較 與control組相比，baicalin組PDLSCs中β-catenin、Cyclin D1和c-myc表達水平均明顯升高 (P<0.05)，與baicalin組相比，baicalin+XAV939組PDLSCs中β-catenin、Cyclin D1和c-myc表達水平均明顯降低 (P<0.05)。見圖6。

圖6 Western blot檢測PDLSCs中β-catenin、Cyclin D1和c-myc的表達水平Figure 6 Western blot detection of β-catenin,Cyclin D1 and c-myc expression levels in PDLSCs注：與control組相比，①P<0.05；與baicalin組相比，②P<0.05

3 討論

黃芩苷作為中藥黃芩的主要活性成分，具有抗炎、抗腫瘤和抑菌等多種藥理活性[9]。有研究表明，黃芩苷能夠促進骨細胞增殖和分化，在治療骨質疏松、骨性關節炎等方面發揮一定的作用[10-11]。李晨睿等[12]研究顯示，黃芩苷能夠通過調控Wnt/β-catenin信號通路促進大鼠骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化。間充質干細胞能夠分化為其他細胞系，例如骨骼、脂肪、軟骨和肌肉，從而使基于細胞療法的組織再生成為可能[13]。PDLSCs這種組織特異性干細胞系在一定的培養條件下可以分化為成骨細胞、成軟骨細胞和脂肪細胞，因此PDLSCs是用于牙周組織再生的有前途的方法。

近年來，研究者在如何提高PDLSCs增殖和分化能力方面做了大量的研究[14]。PDLSCs活性和數量的增加對于損傷的牙周組織重建具有十分重要的作用[15]。本研究顯示，黃芩苷能夠促進PDLSCs的增殖能力。細胞遷移在諸如發育，炎癥和傷口愈合的生物學過程中是必不可少的。在修復和再生過程中，干細胞的遷移是關鍵事件。PDLSCs作為牙周組織中的功能性干細胞，可以遷移到損傷部位，并分化為成纖維細胞，成骨細胞和成軟骨細胞，并參與牙周再生[16]。本研究結果顯示，黃芩苷促進了PDLSCs黏附和遷移。提示黃芩苷可能通過促進PDLSCs增殖、黏附和遷移抑制牙周病的進展。此外，本研究結果還顯示，黃芩苷上調了ALP活性，同時促進了人PDLSCs的成骨相關基因OCN、RUNX2和OPN的表達。大量研究顯示，ALP活性在一定程度上反映骨活性，也是骨礦化和骨形成的標志物之一。當具有成骨分化特性的細胞開始向成骨分化時，ALP活性逐漸升高[17]。事實證明OCN參與控制礦化過程，出現在成骨分化的后期。RUNX2是成骨過程中最重要的轉錄因子，并負責激活成骨細胞分化標記基因。OPN是一種調節蛋白，對成骨細胞的分化、增殖和骨形成至關重要。OCN、RUNX2和OPN與PDLSCs成骨分化的多個步驟密切相關[18]。本實驗結果表明，使用黃芩苷可能會誘導PDLSCs的成骨分化，提示黃芩苷在牙周組織形成和重組中能夠發揮促進作用。

既往研究表明，Wnt/β-catenin信號通路參與了PDLSCs的增殖和成骨分化[19]。提示該信號通路可能在黃芩苷誘導的PDLSCs的成骨標志物表達中起作用。在本研究中，黃芩苷干預的PDLSCs中β-catenin、Cyclin D1和c-myc的表達顯著上調，表明黃芩苷可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路提高PDLSCs的增殖活性及成骨分化能力。本研究在黃芩苷干預的PDLSCs中添加Wnt/β-catenin信號通路特異性抑制劑XAV939,結果發現，XAV939能夠部分逆轉黃芩苷對PDLSCs增殖和成骨分化的促進作用。證實了黃芩苷可通過激活Wnt/β-catenin信號通路發揮調控PDLSCs生物學特性的作用。

4 結論

黃芩苷可有效促進PDLSCs的增殖、黏附和遷移，同時促進成骨分化，該機制可通過Wnt/β-catenin信號傳導途徑介導。了解黃芩苷對PDLSCs生物學特性的影響和分子調節機制可能有助于闡明黃芩苷在牙周發育和牙周疾病中的作用，為牙周組織修復的臨床研究提供了實驗依據。