下調NLRP3在2型糖尿病中表達對胰島素抵抗模型脂肪細胞炎癥反應及自噬的影響*

沙依拉·海米提 阿地拉·阿里木 阿不拉江·玉孫 王新玲 張穗鄉

(1.新疆自治區人民醫院內分泌科，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆醫科大學基礎醫學院，新疆 烏魯木齊 830000)

寡聚化結構域樣蛋白受體3(NOD family,pyrin domain containing-3,NLRP3)是NOD家族中研究最為成熟的成員之一，同時也是生物體內表達最為廣泛、生物作用作為多樣的一類炎性小體[1-2]。近年來大量研究證實NLRP3在2型糖尿病(type-2 diabetes mellitus disease,T2DM)的發病機制中起著至關重要的作用[3-6]。T2DM是以胰島素抵抗(insulin resistance,IR)與慢性炎癥為主要特征的代謝紊亂性疾病[7]。其中，機體的脂肪組織作為體內最大的能量儲備系統，其不僅在血糖控制及脂類代謝過程中發揮著重要的作用，還能通過內分泌功能參與調節機體的免疫代謝過程[8-11]。但關于NLRP3對T2DM中發生IR的脂肪細胞的作用尚不明確。本文研究了NLRP3在脂肪細胞發生IR條件下的作用，有望為靶向NLRP3的T2DM治療提供新的啟迪。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018年3月～2019年5月在新疆自治區人民醫院內分泌科初診為T2DM的患者60例,設為T2DM組。另選取同期本院體檢中心的健康正常體檢者60例作為正常對照組(Normal組)。T2DM的診斷標準參考中華醫學會糖尿病分會制定的《中國2型糖尿病防治指南(2017年)》[12]。T2DM組納入標準：①符合上述糖尿病診斷標準。②無合并心腦血管、肝腎、呼吸系統及胃腸等其他系統疾病或惡性腫瘤。③非妊娠期或哺乳期婦女。④3月內未發生酮癥酸中毒或高滲性昏迷。⑤6月內未服用任何降糖藥物治療。本研究對象均簽署知情同意書，并經新疆自治區人民醫院倫理委員會審核、批準。

1.2 細胞系及主要試劑 前脂肪細胞3T3-L1株購自中國科學院上海細胞庫；地塞米松，胰島素(insulin)、異丁基甲基黃嘌呤(isobutylmethylxanthine,IBMX)(美國Sigma公司)；Trizol、BCA試劑盒、逆轉錄試劑盒(美國Thermo 公司)；實時定量PCR試劑盒(廣州瑞博生物公司)；轉染試劑脂質體Lipofectamine3000 (美國Invitrogen公司)；靶向下調NLRP3表達的小干擾RNA(si-NLRP3)及其陰性對照序列(si-negative control,si-NC)(上海吉瑪生物公司);油紅O染色試劑盒(武漢博士德生物公司)；葡萄糖氧化酶試劑盒(江蘇碧云天生物公司)；大鼠抗Beclin1、GAPDH單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；大鼠抗LC3B多克隆抗體、大鼠抗p62單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；辣根過氧化酶標記(HRP)的兔抗大鼠IgG(武漢博士德生物科技公司)；PCR引物(上海生工)；其他試劑均為國產分析純。電泳槽、電泳儀及化學發光熒光成像系統(美國Bio-Bad公司)。

1.3 檢測方法

1.3.1 生化指標檢測 所有研究對象均隔夜禁食8～10 h后采集肘靜脈血進行檢測各項生化指標。采用全自動生化分析儀檢測所有患者的血糖指標：空腹血糖值(FPG)、餐后2 h血糖(2 h PG)，糖化血紅蛋白(HbA1c)；。采用放射免疫法測定空腹胰島素水平(FINS)。根據FPG與FINS計算IR指數(HOMA-IR)，計算公式：HOMA-IR =[(FPG×FINS)/22.5]；根據受試者身高體重計算體質量(BMI)，BMI=體重(kg)/身高2(m2)。

1.3.2 酶聯免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 參考NLRP3、白介素1β(interlukin-1β,IL-1β)、白介素18(interlukin-18,IL-18)的ELISA檢測試劑盒使用說明方法檢測相應樣本中的上述細胞因子表達。實驗單獨進行3次。

1.3.3 細胞的培養及誘導分化 參照文獻[13]培養前脂肪細胞3T3-L1并誘導其分化為成熟脂肪細胞，方法如下：常規復蘇3T3-L1前脂肪細胞，使用含有10%FBS的DMEM/HG培養基進行培養，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養。當細胞生長融合至90%以上時，在上述培養基中加入0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、10 μg/mL Insulin進行誘導分化，同上條件培養48 h,更換為10 μg/mL Insulin與10% FBS的DMEM/HG培養基繼續培養48 h,再將培養基更換為10% FBS的DMEM/HG培養基進行持續培養，48 h更換培養基1次。選擇誘導分化8 d至12 d的3T3-L1細胞進行成熟脂肪細胞的鑒定。

1.3.4 油紅O染色 收集生長狀態良好的經誘導分化后的3T3-L1細胞，PBS離心洗滌細胞后，在室溫下將其固定于1 mL 10%的甲醛溶液中2 h,PBS再次洗滌細胞后，室溫下晾干細胞，加入0.3%油紅染色溶液250 μl于室溫下避光染色1 h,60%異丙醇充分漂洗后置于顯微鏡下觀察，拍照。

1.3.5 IR模型的建立 將方法1.3.3中誘導分化的成熟脂肪細胞3T3-L1分為正常對照組(記為A組)與IR模型組(記為B組)，A組使用含10% FBS DMEM/HG的常規培養基進行培養，B組使用含1 μmol/L地塞米松與10% FBS的DMEM/HG培養基進行誘導IR,兩組細胞按上述條件培養48 h后，收集兩組細胞培養上清液。使用含100 nmol/L Insulin的常規培養基處理上述不同條件培養48 h后的A、B組細胞30 min,收集各組細胞培養上清液。參考葡萄糖氧化酶試劑盒使用方法檢測所收集的上清液中葡萄糖含量，以未接種細胞的空白培養基作為葡萄糖含量的基礎值，所測結果減去每組基礎值即為每組葡萄糖消耗量。

1.3.6 細胞轉染及分組 分別取生長狀態良好的3T3-L1脂肪細胞，細胞計數后，按2×105個/mL接種于24孔板中進行IR模型誘導后，加入100 μl Opti-MEM溶液，并根據LipofectamineTM3000說明書方法將si-NLRP3、si-NC轉染入細胞中。將轉染后的細胞置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中進行培養8 h后即可進行檢測轉染效率及后續相關實驗。將轉染后的3T3-L1脂肪細胞分為四組，分別為si-NC組，即轉染si-NC的3T3-L1細胞；si-NLRP3組，即轉染si-NLRP3的3T3-L1細胞；IR-si-NC組，即在IR模型中轉染si-NC的3T3-L1細胞；IR-si-NLRP3組，即在IR模型中轉染si-NLRP3的3T3-L1細胞。

1.3.7 實時熒光定量PCR(RT-PCR) 取方法1.3.6不同處理的各組3T3-L1細胞，TRIzol法提取細胞中總RNA,分光光度計檢測濃度與純度后，根據逆轉錄試劑說明書逆轉錄為cDNA,再按照RT-PCR試劑說明書及預實驗確定的反應時間與溫度進行實時定量，RT-PCR反應條件為：95 ℃(30 s)預變性后，變性95 ℃(7 s)→退火60 ℃(30 s)→72 ℃(15 s)，40個循環周期。RT-PCR引物序列為：NLRP3-上游：5′-AGAAGAGACCACGGCAGAAG-3′,NLRP3-下游：5′-CCTTGGACCAGGTTCAGTGT-3′；GAPDH-上游:5′-GCATTGTGGAAGGGCTCATG-3′，GAPDH-下游:5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt方法分析NLRP3 mRNA的表達。上述實驗單獨重復3次。

1.3.8 Western blot實驗 取方法1.3.6不同處理的各組3T3-L1細胞，RIPA細胞裂解液及蛋白酶抑制劑進行提取細胞中的總蛋白。BCA法進行蛋白定量后，將蛋白樣品進行加熱變性。取30 μg的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳進行蛋白分離，采用濕轉法將分離的蛋白轉至PVDF膜上，5%的脫脂牛奶于室溫下封閉2 h后,分別加入LC3B(1∶300)、Beclin1(1∶300)、p62(1∶300)、GAPDH (1∶1000)一抗，4 ℃搖床孵育過夜。TBST溶液清洗3次，5 min/次，以辣根酶標記的二抗(1∶5000)室溫孵育1 h,以TBST溶液清洗3次，5 min/次。最后均勻滴加ECL發光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照。Image J軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白與內參GAPDH的比值作為其相對含量。以上實驗單獨重復3次。

2 結果

2.1 兩組受試者一般資料比較 T2DM組與Normal組在性別、年齡及BMI方面相比，差異均無統計學意義(P>0.05)，而FPG、2 h PG、HbA1c、FINS及HOMA-IR相比，T2DM組較Normal組均明顯增加，差異均具有統計學意義 (P<0.05)，見表1。

表1 兩組受試者的一般臨床資料比較Table 1 General clinical data of the two groups

2.2 NLRP3在T2DM患者血清中的表達 與Normal組相比，NLRP3在T2DM組血清中的表達顯著增加 (P<0.01)，見圖1。

圖1 NLRP3在兩組患者血清中的表達Figure 1 The expression level of NLRP3 in serum of T2DM patients increased significantly注：與Normal組相比，①P<0.01

2.3 成熟脂肪細胞分化的鑒定 油紅O染色進行鑒定誘導后3T3-L1細胞，觀察顯示前脂肪細胞3T3-L1呈長梭形貼壁生成，而誘導后細胞形狀變圓，體積增大，經油紅O染色觀察可見細胞核周圍有大量脂滴環繞，呈“戒環狀”。見圖2。

圖2 油紅O染色觀察3T3-L1前脂肪細胞誘導分化Figure 2 Induced differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes was observed by oil red O staining注：黑色箭頭指示3T3-L1脂肪細胞中脂滴呈“戒環狀”

2.4 脂肪細胞IR模型的鑒定 應用葡萄糖氧化酶法鑒定3T3-L1細胞的IR模型，結果顯示3T3-L1脂肪細胞經DEX培養48 h后與Normal組相比，IR模型組細胞的上清液中葡萄糖消耗量顯著降低 (P<0.05)，再經胰島素刺激后與Normal組相比，IR模型組細胞的上清液中葡萄糖消耗量亦明顯降低 (P<0.05)。提示成功建立了3T3-L1脂肪細胞的IR模型，見圖3。

圖3 3T3-L1脂肪細胞IR模型的鑒定Figure 3 Identification of insulin resistance model of 3T3-L1 adipocytes注：A.Normal組；B.IR模型組。與Normal組相比，①P<0.01

2.5 轉染si-NLRP3后IR模型中脂肪細胞對NLRP3的表達 RT-PCR結果顯示，與si-NC組相比，si-NLRP3組與IR-si-NLRP3組的3T3-L1細胞中NLRP3 mRNA的表達均顯著降低 (P<0.05)，而IR-si-NC組細胞中NLRP3 mRNA的表達明顯升高 (P<0.05)，提示IR能夠促進NLRP3 mRNA的表達，而轉染si-NLRP3后能夠顯著降低其表達，見圖4。

圖4 RT-PCR檢測各組細胞中NLRP3 mRNA的表達Figure 4 The expression level of NLRP3 mRNA in each group was detected by RT-PCR注：與si-NC組細胞相比，①P<0.05

2.6 下調NLRP3表達對IR模型中脂肪細胞炎癥因子表達的影響 ELISA檢測各組3T3-L1細胞種炎癥因子IL-1β、IL-18的表達水平，結果顯示與si-NC組相比，IR-si-NC組與IR-si-NLRP3組中IL-1β、IL-18表達均顯著增加 (P<0.05)，而si-NLRP3組無顯著變化(P>0.05)；與IR-si-NC組相比，IR-si-NLRP3組中IL-1β、IL-18表達均明顯降低 (P<0.05)，見表2。

表2 各組脂肪細胞對炎癥因子IL-1β、IL-18的表達Table 2 The expression of IL-1β and IL-18 in adipocytes of each group

2.7 下調NLRP3表達對IR模型中脂肪細胞對葡糖糖攝取的影響 葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測結果顯示，與si-NC組細胞相比，IR-si-NC組與IR-si-NLRP3組中葡萄糖消耗量顯著降低 (P<0.05)，而si-NLRP3組無顯著變化(P>0.05)；但與IR-si -NC組相比，IR-si-NLRP3組中脂肪細胞對葡萄糖消耗量顯著增加 (P<0.05)，見圖5。

圖5 各組脂肪細胞對葡萄糖消耗量的檢測Figure 5 The detection of glucose consumption in adipocytes注：與si-NC組相比，①P<0.05;與IR-si-NC組相比，②P<0.05

2.8 下調NLRP3表達對IR模型中脂肪細胞自噬的影響 Western blot檢測各組細胞中自噬相關蛋白LC3B與Beclin1和p62的表達，結果表明在si-NC組與si-NLRP3組3T3-L1細胞中自噬標志性分子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1蛋白較IR-si-NC組與IR-si-NLRP3組顯著增加 (P<0.05)，而p62蛋白明顯降低 (P<0.05)；但與IR-si-NC組相比，IR-si-NLRP3組細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1蛋白明顯增加 (P<0.05)，p62蛋白顯著降低 (P<0.05)，見圖6。

圖6 Western blot檢測各組脂肪細胞中自噬相關蛋白表達Figure 6 The expression of autophagy related proteins in adipocytes was detected by Western blot注：與si-NC組細胞相比，①P<0.05;與IR-si-NC組細胞相比，②P<0.05

3 討論

T2DM作為一種能量代謝障礙相關的代謝綜合征，其同樣也是一種由慢性炎癥引起的炎癥性疾病，胰島β功能損害及IR是引起T2DM的兩大重要病理特征[14]。目前T2DM在全世界范圍內呈流行現象，尤其在我國，有數據報道每10個成年人中就有1個糖尿病患者，嚴重危害人們的健康及社會經濟的發展[15]。而NLRP3作為能夠在細胞內與凋亡相關斑點蛋白(caspase recruitment domain,ASC)和半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1)相互結合形成具有生物活性炎性小體，并激活下游促炎因子IL-1β與IL-18等的分泌，從而參與T2DM的發生發展。同時，Oslowski團隊與Lenner團隊發現由代謝紊亂而引起的內質網應激能夠誘導胰島β細胞中硫氧還原蛋白相互作用蛋白的表達，而后者又能通過抑制NLRP3炎癥小體的活化及下游IL-1β的分泌，從而促進胰島β細胞的存活[16-17]。此外，大量學者在NLRP3炎性小體活化的信號通路上利用基因敲除小鼠研究證實，飲食誘導的NLRP3炎癥小體活化是引起IR及糖耐量受損的主要“幕后推手”[18-19]。本實驗通過觀察對比T2DM患者與正常對照組血清NLRP3的表達，結果表明NLRP3在T2DM患者血清中的表達異常增加，這與上述文獻的結果一致，提示NLRP3可能與T2DM的發生發展具有相關性。

機體脂肪細胞主要通過調控葡萄糖的運輸能力來影響脂質的存儲及相關細胞因子的分泌，而脂肪細胞的功能障礙會造成其對胰島素的敏感性降低[20]。大量研究證實在T2DM中脂肪細胞發生了IR[9]。同時，脂肪細胞的IR將顯著降低其對葡萄糖的吸收及利用，進一步促進脂肪組織在其他組織或器官的異常累積，降低其對胰島素的敏感性，最終形成系統性的IR[21]。有學者報道在肥胖及高脂血癥患者的脂肪組織中NLRP3的表達較健康人群明顯增加，通過降低NLRP3炎性小體的表達能夠下調脂肪細胞對促炎因子IL-1β及IL-18表達[10-11]，而IL-1β與IL-18是T2DM中重要的促炎因子[5]。本研究通過誘導前脂肪細胞3T3-L1分化為成熟脂肪細胞，并利用地塞米松誘導其形成IR模型以模擬T2DM中脂肪細胞的狀態，并應用siRNA技術下調NLRP3在脂肪細胞中的表達，ELISA實驗證實下調脂肪細胞中NLRP3的表達能顯著降低IR模型中的脂肪細胞對IL-1β、IL-18的分泌，并促進其對葡萄糖的攝取，這與其他學者的研究報道相似，均表明下調脂肪細胞中NLRP3表達能抑制其對下游IL-1β、IL-18的分泌水平，并促進其對葡萄糖的利用。

自噬是廣泛存在于真核細胞內的一種具有自我保護作用的生理現象，其基本的功能是保證細胞的活力，負責細胞器的更新。Zhang Y等[22]學者最近提出NLRP3可以通過其特殊的分子結構域與自噬啟動蛋白Beclin1相互作用，負向調控細胞的自噬水平。在本研究中我們檢測IR模型的脂肪細胞的自噬水平，結果表明下調細胞中NLRP3表達能夠顯著促進細胞的自噬水平，同時自噬相關蛋白Beclin1表達顯著增加。LC3-Ⅰ脂質化并形成膜結合的LC3-Ⅱ是自噬體形成的關鍵步驟，同時也被用來作為自噬發生的檢測標準，而LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值能夠有效反應兩者之間的動態轉換過程。p62是細胞內自噬過程中特異性底物及調節蛋白，同時也被用來作為衡量自噬的完成情況[23]。下調IR模型中脂肪細胞的NLRP3表達能顯著促進LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的增加及降低p62蛋白水平，這提示下調NLRP3能夠促進IR模型中脂肪細胞的自噬水平。

4 結論

NLRP3在T2DM中的表達顯著增加，通過下調胰島素抵抗模型中脂肪細胞NLRP3表達能夠有效降低其對炎癥因子IL-1β、IL-18的分泌，促進其對葡萄糖的攝取，并增加細胞的自噬水平。