黃芩素對2型糖尿病小鼠GLP-1及胰高血糖素分泌的影響

鄭延坤 朱丹 王寧

(首都醫科大學附屬北京同仁醫院 1.綜合內科;2.老年醫學科,北京 100176)

糖尿病是一組以糖代謝異常，血液中葡萄糖水平慢性增高為特征的代謝性疾病，長期持續的高血糖可導致心腦血管疾病、糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變、糖尿病神經病變等并發癥，危及患者生命[1]。以往研究認為，胰島β細胞功能受損導致胰島素分泌不足或絕對缺乏是糖尿病的主要發病機制，近年來隨著對糖尿病發病機制認識的深入，認為胰高血糖素的絕對或相對過多也在糖尿病發病中起重要作用[2]。胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)是腸粘膜內分泌細胞分泌的一種多肽激素，可通過抑制胰高血糖素的釋放同時增加胰島素分泌，而改善機體對胰島素的抵抗[3-4]。目前靶向GLP-1的藥物已逐漸應用于臨床糖尿病的治療，并取得了一定療效[5]。黃芩素是中藥材黃芩中含量最高的黃酮類化合物之一，已有研究表明，黃芩素對2型糖尿病大鼠的糖代謝和腎功能具有保護作用[6]。但黃芩素是否影響GLP-1和胰高血糖素的分泌尚不清楚。本研究建立2型糖尿病小鼠模型，觀察黃芩素對小鼠GLP-1和胰高血糖素分泌的影響，以期為糖尿病的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取40只8周齡健康C57BL/6J小鼠，SPF級，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。對實驗小鼠的處理符合動物倫理要求，并經醫院倫理委員會審核、批準。

1.2 主要試劑 鹽酸二甲雙胍片，規格0.25 g/片，購自北京京豐制藥集團有限公司；黃芩素，純度≥98%，規格20 mg/支，購自北京華業寰宇化工有限公司；鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)購自北京博愛港生物科技有限公司；小鼠胰島素酶聯免疫吸附檢測試劑盒和小鼠胰高血糖素酶聯免疫吸附檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；小鼠GLP-1酶聯免疫吸附檢測試劑盒購自北京方程生物公司；實驗用引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。

1.3 方法

1.3.1 建立2型糖尿病小鼠模型及分組 40只8周齡的C57BL/6J小鼠適應性飼養1周后，將其隨機分為兩組：正常飼養組(正常組，10只)和高脂飼養組(30只)。正常組給予普通飼料喂養，高脂飼養組給予高脂飼料喂養，兩組小鼠均自由飲水、攝食，4周后給予高脂飼養組小鼠單次腹腔注射STZ 110 mg/kg(稱取STZ配成1%的枸櫞酸鹽溶液)，同時給予正常組小鼠腹腔注射相應體積的枸櫞酸鹽緩沖液，分別于注射3 d和7 d時，將小鼠禁食12 h于次日清晨尾尖采血，測小鼠空腹血糖(Fasting blood-glucose,FBG)值，模型組小鼠空腹血糖值均≥11.1 mmol/L則提示2型糖尿病小鼠模型建立成功。將30只造模成功的2型糖尿病小鼠再隨機分為3組：模型組、二甲雙胍組和黃芩素組，每組各10只。二甲雙胍組給予二甲雙胍0.30 g/kg灌胃，黃芩素組給予黃芩素250 mg/kg灌胃，正常組和模型組則給予等量的生理鹽水灌胃，每天灌胃1次，連續灌胃6周。

1.3.2 檢測指標 分別于灌胃開始前和灌胃結束后，小鼠禁食12 h,尾尖采血，使用血糖儀測定空腹血糖(FBG)和餐后2 h血糖值(2 h PBG)，采用酶聯免疫吸附實驗測定空腹胰島素和胰高血糖素；另取血樣于干燥肝素試管中，迅速加入20 μL二肽基肽酶Ⅳ抑制劑，置于離心機中以3000 r/min離心10 min,取上層血清，采用酶聯免疫吸附法測定血清中GLP-1水平。

1.3.3 小鼠回腸組織中胰高血糖素原(proglucagon,PG)和前激素轉化酶(PC1/3)基因表達檢測 各組小鼠灌胃6周后，每組選取5只小鼠處死，取回腸組織。采用TRIzol試劑法提取組織總RNA,紫外分光光度計檢測提取RNA樣品的濃度和質量。參照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應合成cDNA。利用ABI實時熒光定量PCR系統進行定量PCR反應，反應程序：94 ℃，5 min;94 ℃，30 s、59 ℃，30 s、72 ℃，30 s,共35個循環；72 ℃，5 min。引物序列：PG正向5′-G TAATGCTGGTACAAGGCAG-3′，反向5′-TTATA AAGTCCCTGGCGGCA-3′；PC1/3正向5′-CGCTG ACCTGCACAATGACT-3′，反向5′-CAGACAACCA GGTGCTGCAT-3′；GAPDH正向5′-GCTGAGAAG CCCAAGCTTGT-3′，反向5′-TCTCCATGGTGGTG AAGACG-3′。結果以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算組織中PG和PC1/3 mRNA相對表達水平。

1.3.4 腹腔注射葡萄糖耐量實驗(IPGTT) 各組小鼠灌胃6周后，每組選取5只，禁食15 h(自由飲水)后，給予500 mg/kg的葡萄糖腹腔注射，分別于注射后0、30、60、120 min采集尾尖靜脈血，測定血糖和胰高血糖素。

2 結果

2.1 各組小鼠給藥前后FBG和2 h PBG比較 給藥前，模型組、二甲雙胍組和黃芩素組FBG和2 h PBG均顯著高于正常組 (P<0.05)；給藥后，與模型組比較，二甲雙胍組和黃芩素組FBG和2 h PBG均顯著降低 (P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠給藥前后FBG和2 h PBG比較Table 1 Comparison of FBG and 2 h PBG before and after administration

2.2 各組小鼠給藥前后胰島素和胰高血糖素比較 給藥前，與正常組比較，模型組、二甲雙胍組和黃芩素組胰島素水平均顯著降低 (P<0.05)，胰高血糖素水平均顯著升高 (P<0.05)；給藥后，與模型組比較，二甲雙胍組和黃芩素組胰島素水平均顯著升高(P<0.05)，胰高血糖素水平均顯著降低 (P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠給藥前后胰島素和胰高血糖素比較Table 2 Comparison of insulin and glucagon between groups before and after administration

2.3 各組小鼠給藥前后血清GLP-1比較 給藥前，與正常組比較，模型組、二甲雙胍組和黃芩素組血清中GLP-1水平均顯著降低 (P<0.05)；給藥后，與模型組比較，二甲雙胍組和黃芩素組血清中GLP-1水平均顯著升高 (P<0.05)。見表3。

2.4 各組小鼠回腸組織中PG和PC1/3 mRNA相對表達水平比較 給藥后，與正常組比較，模型組小鼠回腸組織中PG mRNA相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)，PC1/3 mRNA相對表達量顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，二甲雙胍組和黃芩素組小鼠回腸組織中PG 、PC1/3 mRNA相對表達量均明顯上升 (P<0.05)。見表4。

表4 PG和PC1/3 mRNA相對表達水平比較Table 4 Comparison of relative mRNA expression levels of PG and PC1/3

2.5 各組不同時間點血糖和胰高血糖素水平比較 葡萄糖注射后0、30、60、120 min,模型組血糖和胰高血糖素均顯著高于正常組 (P<0.05)，二甲雙胍組和黃芩素組血糖和胰高血糖素均顯著低于模型組 (P<0.05)。見表5。

表5 各組不同時間點血糖和胰高血糖素水平比較Table 5 Comparison of blood glucose and glucagon levels in each group at different time points

3 討論

黃芩素是傳統中藥黃芩發揮功效的主要活性成分，研究表明黃芩素對糖尿病及其并發癥的治療具有顯著療效，如黃芩素通過抑制NF-kB活性、減少尿白蛋白等，延緩早期糖尿病腎病的進展；通過抑制p38 MAPK通路、抗氧化應激等途徑，延緩糖尿病周圍神經病變的發生[7-8]。本研究發現黃芩素灌胃給藥6周能夠有效降低2型糖尿病小鼠的FBG和2 h PBG水平，效果與二甲雙胍一致。

胰高血糖素是由胰島α細胞分泌的一種多肽類激素，作為胰島素的拮抗激素，其主要作用機理是通過促進糖異生和糖原分解過程，調控血糖的升高，為糖尿病治療提供的新的方向[9-10]。本研究結果提示，黃芩素灌胃給藥6周后，2型糖尿病小鼠血液中胰島素水平明顯升高，而胰高血糖素水平明顯降低，說明黃芩素能夠抑制糖尿病小鼠的胰高血糖素分泌。GLP-1由胰高血糖素原基因表達，在胰島α細胞中，胰高血糖素原基因的主要表達產物是胰高血糖素，而在腸黏膜的L細胞中，PC1/3將胰高血糖素原剪切為GLP-1[11-13]。GLP-1的主要生理作用是通過抑制胰島α細胞分泌胰高血糖素，同時刺激胰島β細胞分泌胰島素，以達到降低血糖的目的[14-15]。本研究中，黃芩素灌胃給藥后，2型糖尿病小鼠血清中GLP-1水平明顯升高，檢測小鼠回腸組織中胰高血糖素原基因和PC1/3基因表達，發現黃芩素處理后小鼠回腸組織中胰高血糖素原基因和PC1/3基因表達明顯上調，提示黃芩素能夠促進糖尿病小鼠GLP-1的分泌。王森[16]研究表明，GLP-1缺乏可能是糖尿病患者胰島素分泌過少，胰高血糖素分泌過多的重要因素。提示黃芩素對2型糖尿病小鼠胰島素和胰高血糖素的調節作用可能與促進腸粘膜細胞分泌GLP-1有關。

葡萄糖耐量是指機體對血糖濃度的調節能力[17]。正常生理狀態下，進餐后血糖濃度升高可刺激胰島素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌，維持血糖在穩定范圍；然而糖尿病患者的葡萄糖耐受能力降低，存在胰島素抵抗，而胰島素抵抗可引起胰島α細胞分泌胰高血糖素增多，導致血糖進一步升高[18-19]。本研究通過葡萄糖耐受實驗評估黃芩素對2型糖尿病小鼠胰高血糖素動態分泌功能的影響，結果與模型組小鼠比較，黃芩素組小鼠在葡萄糖注射后0、30、60、120 min的胰高血糖素分泌均明顯降低，與二甲雙胍作用效果一致。提示黃芩素可通過降低糖尿病小鼠糖負荷后胰高血糖素分泌來改善血糖水平，其作用也可能與促進腸粘膜細胞分泌GLP-1有關。

4 結論

黃芩素能夠通過調控2型糖尿病小鼠GLP-1和胰高血糖素的分泌，改善糖代謝紊亂。為黃芩素用于臨床糖尿病的治療提供了新的實驗依據。