外周血LncRNA MIR155HG、miR-155檢測在肺結核篩查中的臨床價值

李君莉，趙慧姝

(成都市公共衛生臨床醫療中心呼吸科，成都 610066)

肺結核是一種由結核分枝桿菌引發的疾病，當結核分枝桿菌感染機體后，若機體免疫功能低下，潛伏結核感染(latent tuberculosis infection, LTBI)可進展為活動性肺結核(active tuberculosis, ATB)[1]。目前研究認為，肺結核發生、發展不僅與免疫炎癥反應有關，還與長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)、微小RNA(microRNA, miRNA)等異常表達相關[2]。研究表明，微小RNA-155(microRNA-155, miR-155)在肺結核患者外周血中呈過表達，且可能影響肺結核疾病的進程[3]。另有學者發現，LncRNA MIR155宿主基因(lncRNA MIR155 host gene, LncRNA MIR155HG)在肺纖維化中表達上調，其可能參與肺纖維化過程[4]。本研究旨在檢測LncRNA MIR155HG、miR-155在ATB患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的表達水平，分析LncRNA MIR155HG、miR-155之間的相關性，評估二者對ATB的臨床篩查價值及其與預后的關系，以期為臨床診治ATB、評估病情及預后提供依據。

1 資料與方法

1.1研究對象 收集2017年6月至2020年7月阿壩藏族羌族自治州人民醫院感染科收治的130例肺結核患者作為肺結核組，其中男72例，女58例，年齡(44.11±9.72)歲；體質指數(body mass index, BMI)為(17.00～24.81)kg/m2，平均BMI為(20.99±2.83)kg/m2；其中活動性肺結核(ATB)患者56例(ATB組)、潛伏結核感染(LTBI)患者74例(LTBI組)。納入標準：(1)均符合《肺結核診斷和治療指南》[5]中相關肺結核診斷標準；(2)病歷資料齊全；(3)ATB患者至少滿足：有活動性病灶、結核中毒癥狀、痰液檢測抗酸染色陽性1次及以上中的2個條件；(4)LTBI患者結核感染T細胞檢查為陽性，與ATB高危人群接觸密切，其細菌學、X線胸片檢查為陰性，無肺結核臨床癥狀。排除標準：(1)合并高血壓、惡性腫瘤、糖尿病者；(2)妊娠、哺乳期女性；(3)合并丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒感染、自身免疫性疾病、使用免疫抑制藥物者；(4)伴有精神障礙者。治療方案：ATB患者接受標準化抗結核治療[5]。療效評價：ATB患者接受6個月治療后，若臨床癥狀消失，痰涂片陰性，胸片正常定義為治愈(治愈患者35例，治愈組)，否則為未治愈(未治愈患者21例，未治愈組)。選取同期本院體檢健康者134例作為健康人對照組，其中男71例，女63例；年齡(44.87±9.96)歲；BMI為(17.07～25.02)kg/m2，平均BMI為(21.13±2.97)kg/m2。健康人對照組、肺結核組性別構成比例、BMI、年齡比較，差異無統計學意義(χ2/t分別為0.153、0.392、0.627，P分別為0.696、0.695、0.531)。本研究經阿壩藏族羌族自治州人民醫院醫學倫理委員會批準(批準文號：17005-16)，患者及家屬知情同意。

1.2試劑與儀器 人外周血Ficoll淋巴細胞分離液(上海善然生物科技公司)，TRIzol試劑(南京森貝伽生物科技公司)，miRNA提取試劑盒(北京智杰方遠科技公司)，逆轉錄試劑盒(First Strand cDNA Synthesis Kit，北京鼎國昌盛生物技術公司)，寶生物染料法熒光定量試劑盒(SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，美國TaKaRa公司)，miRNA熒光定量試劑盒(美國GeneCopoeia公司)。NanoDrop One超微量紫外分光光度計(北京龍躍生物科技發展公司)，SLAN-96P實時熒光定量PCR儀(上海宏石醫療科技公司)。

1.3標本采集 收集所有肺結核患者入院當日(治療前)及體檢健康者體檢時的清晨空腹外周血5～6 mL，置于含有肝素的抗凝采血管中，使用Ficoll淋巴細胞分離液，按密度梯度離心法分離獲得PBMC，PBS沖洗3次，置于-80 ℃保存。

1.4RNA提取及逆轉錄反應 取上述各研究對象約3×106個PBMC，使用TRIzol試劑抽提總RNA，NanoDrop One超微量紫外分光光度計檢測RNA樣本吸光度(A)值，取A260 nm/A280 nm值為1.8～2.0的樣本用于后續試驗。RNA樣本置于-80 ℃保存。按照逆轉錄試劑盒說明書操作將2 μL RNA樣本逆轉錄為cDNA，樣本置于-20 ℃保存。

1.5實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155表達水平 LncRNA MIR155HG以GAPDH為內參，miR-155以U6為內參，引物序列由上海生工公司使用OligoArchitect 軟件設計并合成。各引物序列見表1。按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ說明書進行PCR擴增。LncRNA MIR155HG的qRT-PCR反應體系為20 μL，包括10 μmol/L上、下游引物各0.7 μL，cDNA 2.0 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)8.5 μL，ddH2O 8.1 μL。循環參數：97 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，62 ℃ 60 s，共40個循環。miR-155的qRT-PCR反應體系為20 μL，包括cDNA 2.0 μL，FastStart Universal SYBR Green Master 8.5 μL，10 μmol/L上、游引物各0.8 μL，ddH2O 7.9 μL。循環參數：97 ℃ 8 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 50 s，共40個循環。LncRNA MIR155HG于62 ℃時，miR-155于60 ℃時使用High Resolution Melting Software v3.0.1軟件采集熒光信號，并分析熔解曲線。采用2-△△Ct法計算LncRNA MIR155HG及miR-155的表達水平。試驗重復3次。

表1 LncRNA MIR155HG、miR-155及內參GAPDH、U6的引物序列

2 結果

2.1各組PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155水平比較 肺結核組患者PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155的表達水平[(1.78±0.57)、(1.65±0.54)]顯著高于健康人對照組[(1.02±0.32)、(1.01±0.33)]，差異有統計學意義(t分別為13.410和11.658，P均<0.05)。進一步進行不同類型肺結核患者間的比較，結果發現ATB組患者PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155的表達水平[(2.02±0.68)、(1.90±0.63)]亦顯著高于LTBI組[(1.55±0.53)、(1.41±0.46)]，差異有統計學意義(t分別為4.430和5.127，P均<0.05)。未治愈組ATB患者PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155的表達水平[(2.34±0.78)、(2.15±0.72)]顯著高于治愈組[(1.83±0.61)、(1.75±0.58)]，差異有統計學意義(t分別為2.725和2.280，P均<0.05)。

2.2ATB、LTBI組患者PBMC中LncRNA MIR155HG與miR-155的相關性 Pearson法分析顯示，ATB、LTBI組患者PBMC中LncRNA MIR155HG的表達水平均與miR-155呈正相關(r分別為0.461、0.397，P均<0.05)。

2.3PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155的表達水平對ATB的篩查價值 以ATB患者為疾病組，LTBI患者、健康者為對照組，依據2組PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155的表達水平繪制ROC曲線，結果見圖1。LncRNA MIR155HG、miR-155篩查ATB的曲線下面積(AUCROC)分別為0.824、0.843；二者聯合篩查ATB的AUCROC為0.917，其敏感性、特異性分別為89.3%、82.4%。見表2。

表2 PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155表達水平對ATB的篩查價值

圖1 PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155篩查ATB的ROC曲線

3 討論

miR-155與肺結核發生、發展關系密切。本研究中肺結核患者PBMC中miR-155的表達水平較高，ATB患者miR-155的表達水平更高，與Kathirvel等[6]、時廣利等[7]的研究趨勢相符，提示miR-155可能在肺結核病變進程中發揮重要調節作用，檢測PBMC中miR-155的表達水平有利于判斷患者病情進展。然而，miR-155在ATB患者PBMC中的表達水平及其篩查價值仍不明確。本研究證實患者PBMC中miR-155篩查ATB的AUCROC為0.843，當miR-155>1.72時，ATB發生風險較大，miR-155可作為篩查ATB的輔助指標。推測高表達miR-155可能通過影響機體免疫應答，調節相關信號轉導，促進機體炎癥反應，進而影響肺結核發生、發展，但具體機制有待深入研究證實。

本研究結果顯示，LncRNA MIR155HG在肺結核患者PBMC中的表達水平較高，與其在慢性阻塞性肺疾病、非小細胞肺癌中的趨勢一致，且其在ATB患者中升高更甚，提示LncRNA MIR155HG可能在肺結核發生、發展中具有重要作用。檢測PBMC中LncRNA MIR155HG的表達水平有助于評估患者病情，究其原因，高水平LncRNA MIR155HG可能通過加重機體炎癥反應，影響免疫調節，從而影響肺結核發病進程，但尚需進一步機制研究證實。筆者通過進一步研究顯示，PBMC中LncRNA MIR155HG篩查ATB的AUCROC為0.824，當PBMC中LncRNA MIR155HG相對表達量>1.81時，ATB發生幾率較高，提示LncRNA MIR155HG對ATB有一定的篩查價值，可輔助篩查ATB。

LncRNA MIR155HG/miR-155軸可能為治療非小細胞肺癌提供新的治療策略。本研究發現ATB患者PBMC中LncRNA MIR155HG的表達水平與miR-155呈正相關，提示LncRNA MIR155HG可能與miR-155相互影響，進而共同影響ATB發生、發展。進一步研究發現，PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155聯合篩查ATB的AUCROC為0.917，敏感性為89.3%，均高于二者單獨檢測，且特異性為82.4%，提示二者聯合可在一定程度上增加對ATB的篩查價值，有助于臨床更好地篩查ATB患者。此外，本研究還發現未治愈的ATB患者PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155的表達水平較高，提示LncRNA MIR155HG、miR-155可能與ATB預后有關，測定PBMC中LncRNA MIR155HG、miR-155的表達可能有利于判定ATB患者是否轉歸。

本研究尚存在一定局限性：(1)研究樣本較少，篩查、預后相關結果有待擴大樣本量進行驗證；(2)LncRNA MIR155HG、miR-155在ATB中的具體機制未深入探究，后續需結合基礎及臨床實驗進一步驗證，為臨床診治ATB提供有力證據。

致謝：感謝阿壩藏族羌族自治州人民醫院感染科對本研究給予的支持！