天麻素對次黃嘌呤誘導小鼠急性高尿酸血癥的影響和機制研究

褚亞慧 孔維佳

中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所病毒室，北京 100050

天麻素（gastrodin，GAS）是中藥天麻的主要有效成分之一，可由天麻的根莖中提取或化學合成獲得。研究發現除了治療神經系統疾病，GAS 還具有其他多種藥理作用[1-4]。最近的研究發現，GAS 用于四氯化碳誘導的小鼠腎損害模型具有降尿酸（uric acid，UA）作用[5]，但其機制尚不明確。高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）可導致痛風和腎功能損害，并與一些代謝性疾病和循環系統疾病的發生和發展密切相關[6-7]。本實驗以次黃嘌呤誘導小鼠的急性HUA，并研究了GAS 的降UA 作用和可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品和試劑

GAS 購自上海麥克林生化科技有限公司（批號：C10915097），別嘌呤醇（allopurinol，ALLO）、次黃嘌呤和羧甲基纖維素鈉購自美國Sigma 公司，血清生化指標檢測試劑盒購自北京中生北控生物科技有限公司。黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究有限公司。QIAsymphony RNA Kit 購自德國QIAGEN 公司，GoScriptTM反轉錄系統和GoTaq?qPCR Master Mix 試劑盒購自美國promega 公司。

1.1.2 實驗動物

雄性昆明種小鼠50 只，體重18～20 g，購自北京康藍生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0011。所有動物于SPF 級動物房適應性飼養一周后開始實驗，自由飲水，投喂常規嚙齒類顆粒飼料。

1.1.3 儀器

7100 型全自動生化分析儀購自QIAGEN 公司，NanoDrop 2000 型超微量分光光度計購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，ABI 7500 Fast 實時熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗

實驗方案由醫藥生物技術研究所倫理委員會審核通過，動物實驗的操作和流程遵循中國實驗動物學會《實驗動物教學用動物使用指南》[8]。動物隨機分為5 組，每組10 只，分別為正常組、模型組、GAS 200 mg/kg組、GAS 400 mg/kg 組和ALLO 10 mg/kg 組。正常組和模型組每日灌胃同等體積0.5%羧甲基纖維素鈉，其余各組每日灌胃給藥。藥物于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中溶解，灌胃體積為0.3 ml/只，持續14 d。

第13 天晚上8∶00 所有動物禁食，第二天上午8∶00 最后一次灌胃給藥。給藥1 h 后除正常組外其余各組動物腹腔（intraperitoneal，i.p.）注射次黃嘌呤1000 mg/kg[9]。次黃嘌呤溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，注射體積為0.2 ml/只。注射45 min 后[9]所有動物眼眶取血置于離心管中，二氧化碳麻醉處死后取肝臟和腎臟置液氮中快速冷凍，然后于-80℃冰箱中凍存。

血標本于室溫靜置2 h 后以3000 rpm（r=7 cm）離心10 min 分離血清。每個血清標本取0.2 ml，分別用相應試劑盒并參考說明書在全自動生化分析儀上測定UA、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血清肌酐（serum creatinine，SCr）、丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天門冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）等生化指標。

1.2.2 肝臟XOD 活力測定

每只小鼠稱取約0.2 g 肝組織，以0.9%生理鹽水按重量體積比1∶9 制成10%勻漿液。于3000 r/min，半徑7 cm 離心10 min，然后取上清按照試劑盒說明書進行測定。反應結束后以分光光度計測量530 nm 的吸光度，結果以U/g 肝組織表示。

1.2.3 組織RNA 提取、反轉錄和實時熒光定量PCR

以試劑盒提取腎組織總RNA 并進行反轉錄。反轉錄的反應體系、溫度和時間等條件參考文獻報道[10]，反應結束后樣品置-20℃凍存。定量PCR 的基因特異性引物見表1，PCR 反應體系、條件和循環數參考文獻報道[10]。反應結束后以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參對目的基因包括尿酸鹽轉運蛋白1（urate transporter 1，URAT1） 和有機陰離子轉運蛋白1（organic anion transporter 1，OAT1）（表1）進行校正，并以文獻報道[10]的方法計算目的基因的相對表達水平，結果以正常組的倍數表示。

表1 實時熒光定量PCR 小鼠引物（5′-3′）

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用Newman-Keuls檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GAS 減輕次黃嘌呤誘導的小鼠急性HUA

模型組小鼠血清UA 水平高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.001）。劑量為200 mg/kg 和400 mg/kg 的GAS 灌胃給藥14 d 使小鼠血清UA 水平下降（與模型組比較，P＜0.05 或P＜0.01）。作為陽性對照藥，劑量為10 mg/kg 的ALLO 灌胃給藥14 d 使小鼠血清UA 水平下降（與模型組比較，P＜0.001），與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。各組的BUN、Scr、ALT 和AST 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表2）。

表2 GAS 和ALLO 對急性HUA 小鼠血清UA、腎功能和肝功能指標的影響（±s）

表2 GAS 和ALLO 對急性HUA 小鼠血清UA、腎功能和肝功能指標的影響（±s）

與正常組比較，aaaP＜0.001，與模型組比較，bP＜0.05、bbP＜0.01、bbbP＜0.001

組別UA（μmol/L）BUN（mmol/L）SCr（μmol/L）ALT（U/L）AST（U/L）正常組（n=10）模型組（n=10）GAS 200 mg/kg 組（n=10）GAS 400 mg/kg 組（n=10）ALLO 10 mg/kg 組（n=10）163.5±21.1 620.8±124.4aaa 504.4±47.6b 373.8±43.1bb 140.5±28.1bbb 6.77±0.72 6.99±0.74 6.43±0.58 6.91±0.70 6.76±0.33 52.20±4.83 56.83±6.93 54.05±4.87 54.81±5.19 56.80±8.46 34.82±4.93 33.09±5.20 32.50±5.39 33.57±4.17 35.33±3.80 131.7±15.9 136.2±16.9 128.3±13.2 133.0±14.1 138.4±19.9

2.2 GAS 抑制小鼠肝臟XOD 活力

模型組小鼠肝臟XOD 活力高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.01）。200 mg/kg 和400 mg/kg 的GAS使小鼠肝臟XOD 活力下降（與模型組比較，P＜0.05 或P＜0.01）。ALLO 使小鼠肝臟XOD 活力下降（與模型組比較，P＜0.01），與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（圖1）。

與正常組比較，aaP＜0.01；與模型組比較較，bP＜0.05、bbP＜0.01

2.3 GAS 下調小鼠腎臟URAT1 而上調OAT1 的mRNA 表達

模型組小鼠腎臟URAT1 的mRNA 表達水平高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖2A），而OAT1的mRNA 表達水平低于正常組，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖2B）。200 mg/kg 和400 mg/kg 的GAS 使小鼠腎臟URAT1 的mRNA 水平減少（與模型組比較，P＜0.05 或P＜0.01）（圖2A），同時使OAT1 的mRNA水平增加（與模型組比較，P＜0.05 或P＜0.01）（圖2B）。ALLO 使小鼠腎臟URAT1 和OAT1 的mRNA 表達水平恢復（與模型組比較，P＜0.01），與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 GAS 和ALLO 對急性HUA 小鼠腎臟URAT1（A）和OAT1（B）mRNA 表達水平的影響（n=10，±s）

3 討論

本研究探討了GAS 對小鼠急性HUA 的作用，并報道了GAS 降UA 的可能機制。次黃嘌呤是UA 生物合成的前體物質之一[11]，本實驗通過i.p.注射次黃嘌呤成功復制了小鼠急性HUA 模型，并發現劑量為200 mg/kg 和400 mg/kg 的GAS 灌胃給藥具有明顯的降UA 作用，能有效減輕小鼠HUA。該結果與近期Ma等[5]的研究結果相一致，提示GAS 對不同因素誘導的小鼠血清UA 升高均具有抑制作用。

XOD 主要分布于肝臟和腸道等組織，是UA 合成的關鍵酶，也是ALLO 等降UA 藥物的主要作用靶點之一[11]。本研究結果顯示，GAS 使小鼠肝臟XOD的活力下降，提示GAS 能抑制肝臟中UA 的合成。另有研究發現，在體外無細胞的反應體系中，濃度低至0.1 μmol/L 的GAS 即能有效抑制XOD 的催化活性，使UA 的產生量明顯減少[12]。本文的結果與之符合，并進一步證明了GAS 在體內對XOD 活力的抑制作用。

URAT1 和OAT1 分別參與腎小管對UA 的重吸收和分泌，在維持體內尿酸代謝平衡方面發揮重要作用[13-14]。目前，URAT1 抑制劑是降尿酸和抗痛風藥物的研發熱點，并且已有多個候選藥物進入臨床試驗階段[15-16]。本研究結果顯示，小鼠i.p.注射次黃嘌呤后腎組織URAT1 的mRNA 表達升高而OAT1 的mRNA表達下降，提示腎臟對UA 的重吸收增加而分泌減少。GAS 灌胃給藥后明顯下調URAT1 的mRNA 表達同時上調OAT1 的mRNA 表達，說明GAS 能抑制腎臟對UA 的重吸收并增加其分泌，從而促進UA 從體內排泄。

目前臨床常用的降尿酸藥物有ALLO、非布司他、苯溴馬隆、丙磺舒等。這些藥物通常有較多不良反應，如過敏反應、藥物性肝炎、消化道反應、血象異常等，并不適合長期應用[17-19]。臨床上口服GAS 不良反應輕微且多呈一過性，大多無需停藥或特殊處理，且未見報道有肝腎功能損害等嚴重不良反應[20-21]。GAS的良好安全性為其進一步研發用于新的臨床適應證奠定了基礎。

綜上所述，GAS 灌胃用于次黃嘌呤誘導的小鼠急性HUA 能有效降低血清UA 濃度，其機制可能與抑制肝臟XOD 活力以及調控腎臟URAT1 和OAT1 的mRNA 表達有關，具有一定的開發和應用前景。