生物信息學及實驗驗證分析SPRR2A基因在肺鱗癌中的表達和臨床意義

周靜 何杰 李小燕 王國棟 余覓 張維 肖秋紅

1成都醫學院臨床醫學院第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科 610500;2 牟平區中醫醫院病理科,煙臺264100

肺癌是全球發病率最高的呼吸系統惡性腫瘤之一。在中國,肺癌的發病率和病死率也是居于多種惡性腫瘤的首位[1]。根據組織病理學分型,肺癌可分為非小細胞肺癌與小細胞肺癌兩大類[2]。肺鱗狀細胞癌是非小細胞肺癌的常見類型之一,約占15%～20%[3]。據報道,肺鱗癌全球每年新發病例約40萬例,雖然該疾病與吸煙密切相關,但肺鱗癌潛在的分子發病機制尚不清楚[4]。同時,肺鱗癌因缺乏有效的早期診斷篩查和靶向藥物治療,在一定程度上造成了肺鱗癌較高的發病率和病死率[5-6]。

富含脯氨酸小蛋白2A (small proline-rich protein 2A,SPRR2A)基因是10個SPRR 基因家族中的成員之一,主要編碼表皮分化復雜區域SPRR 基因家族編碼的蛋白,與細胞分化密切相關,并與其他分化相關基因共同構成表皮分化復合體,協同影響腫瘤細胞的分化[7]。有研究表明SPRR2A 在胃癌組織高表達,胃癌患者血清SPRR2A 水平增高多伴有淋巴結的轉移[8]。Nisa等[9]研究也證明SPRR2A 與頭頸部腫瘤的轉移和復發存在相關性,淋巴結轉移灶中的SPRR2A 呈現高表達。但SPRR2A 在肺鱗癌中的研究尚未報道。本研究通過TCGA 為主的多個數據庫及R 軟件,挖掘肺鱗癌患者中SPRR2A 的表達水平及對肺鱗癌患者預后的影響,并通過臨床樣本及細胞實驗進行驗證,為研究肺鱗癌的診治和評估肺鱗癌患者預后提供一定的實驗證據。

1 資料與方法

1.1 資料來源 SPRR2A 表達采用生物信息學方法,首先在GTEx (http://www.gtexportal.org/home/)數據庫中檢索SPRR2A 基因在人體不同組織器官中的表達水平。在TCGA 數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中分析SPRR2A在不同腫瘤組織及在肺鱗癌中的表達。采用TCGA 數據庫在線分析網站 (http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)比較肺鱗癌患者癌組織和癌旁組織中SPRR2A 基因表達水平。從TCGA 收集486例肺鱗癌和50例癌旁組織的基因表達譜數據和臨床資料,使用R3.6.1軟件將FPKM 的數據格式轉換為TPM 格式用于后續分析。使用ROC曲線評估SPRR2A 的表達量對診斷肺鱗癌的效能。以SPRR2A 表達量的中位數值為區分界限,將肺鱗癌樣本劃分為SPRR2A 高表達組和低表達組。

1.2 材料和試劑 4 株人肺鱗癌細胞系 (SKMES-1,H226,HB-99,H520)和人肺上皮細胞系 (BEAS-2B)購于上海生命科學院;FBS、OptiMEN 及DMEM 購于美國Gbico公司;胰酶消化液購于美國Hyclone公司;Transwell小室購于美國Coring公司;shRNA-SPRR2A 及sh RNA對照組質粒寡核苷酸片段由上海合生生物技術有限公司合成;脂質體Lipofectamine 2000 購于美國Invitrgen公司;SPRR2A 引物序列由杭州齊步生物科技有限公司合成。

1.3 RT-qPCR 和蛋白免疫印跡法 (Western blot,WB)驗證肺鱗癌組織和細胞系中SPRR2A的表達差異 在2018 年1 月至2020 年12 月間,從成都醫學院第一附屬醫院外科接受肺癌切除術的患者中收集了40 對人肺鱗癌樣本和距腫瘤至少5 cm的癌旁正常組織樣本。所有肺鱗癌標本均經病理證實。從這些樣品和細胞株中獲取總RNA 和蛋白質。

1.3.1 RT-qPCR 檢測 使用Trizol提取組織和細胞中總RNA,將500 ng 總RNA 反轉錄為cDNA。使用上海谷研PCR 試劑盒進行RT-qPCR反應,采用20μl反應體系,其中包含0.8μl引物,2μl cDNA 模板,10μl PCR 反應Mix以及7.2μl雙蒸水。采用β-actin作為內參。SPRR2A 上游引物:5'-AGCAGTGCCAGCAGAAATA-3';下 游引物:5'-GGAACGAGGTGAGCCAAATA-3';BACTIN 上游引物:5'-GCTTCTAGGATCCTCTGGCT-3',下游引物:5'-TCCCTTACCCCAGTCTCATA-3'。采用2-ΔΔCt法計算SPRR2A 基因的相對表達量。

1.3.2 WB檢測 裂解并收集組織和細胞中的總蛋白。使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質濃度。吸取50μg蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠分離,電泳完成后用半干轉法將蛋白質轉移到PVDF膜上,將膜用5%脫脂牛奶室溫密封1 h,然后與一抗4 ℃孵育過夜,再與二抗室溫孵育1 h。將增強化學發光 (enhanced chemiluminescence,ECL)滴入PVDF 膜中,后使用曝光機觀察并拍照。選用內參β-actin。

1.4 SPRR2A 差異基因分析 來自TCGA 數據庫中的SPRR2A 高表達組和SPRR2A 低表達組患者之間的差異基因分析通過Wilcoxon秩和檢驗在R軟件中的”limma”程序包中進行分析。設定閾值調整后P＜0.05和|log2FC|＞1.5。所有的差異基因都以熱圖和火山圖形式呈現。

1.5 基因富集分析 采用GSEA 4.1.0軟件對SPRR2A 高、低組的差異基因進行京都基因和基因組百科全書 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics,KEGG)富集分析,設定統計方法為缺省加權富集,隨機組合次數設定為1 000次,當P＜0.05且錯誤發現率 (false discovery rate,FDR)＜0.25時,該KEGG 通路為顯著富集通路。

1.6 SPRR2A 表達與患者生存預后分析 利用R3.6.1軟件Survival包分析2組之間預后的差異,根據下載整理的臨床病例信息和SPRR2A 表達量,比較SPRR2A 高、低表達組間無疾病進展生存和總生存是否存在差異。

1.7 細胞轉染 將SPRR2A 表達量最高的SKMES-1株作為研究對象,胰酶消化生長良好的SK-MES-1細胞,離心計數后,將其接種于6孔板中,在無雙抗含10%FBS培養液中培養48 h,待6孔板中細胞融合度達65%左右時,進行OptiMEM和脂質體Lipofectamine 2000 介導轉染。分別對sh RNA 陰性對照組、sh RNA-SPRR2A 實驗組進行轉染,轉染6 h后,無雙抗含10%的FBS培養基替換原來的培養基,繼續培養48 h后,建立細胞模型進行后續實驗。

1.8 Transwell實驗 使用胰酶將細胞消化為單個細胞,洗滌1次,然后用無血清培養液再懸浮,將Transwell小室放置于24 孔板中,侵襲試驗時在小室的下層添加700μl含20%血清的DMEM-H培養液,上層添加1×105個細胞和無血清稀釋的基質膠,確保上層和下層無氣泡產生,遷移實驗上層小室不添加基質膠。37 ℃和5% CO2培養箱中培養24 h后,小室內棄掉上層培養液,1 ml甲醇室溫固定15 min,再PBS洗滌1次,使用1%結晶紫染色15 min,清水沖洗,并用棉棒擦洗干凈下室,普通顯微鏡下觀察拍照。Image J軟件計算遷移和侵襲的細胞數量。

1.9 統計學分析 采用R 3.6軟件進行數據分析,TCGA 數據庫中,腫瘤組織和癌旁組織差異基因分析采用非參數秩和檢驗。臨床標本腫瘤組織和癌旁組織SPRR2A 的表達差異比較采用配對t檢驗。SPRR2A 高、低表達組間的總體生存率比較采用Kaplan-Meier 法。sh RNA-SPRR2A 組 和sh RNA陰性對照組侵襲和遷移細胞比較,采用獨立樣本t檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SPRR2A 表達水平分析 TCGA 數據庫和GTEx中數據庫中,SPRR2A 基因m RNA 在人體各個組織中表達水平存在差異,肺鱗癌患者癌組織中的SPRR2A m RNA 表達水平明顯高于癌旁正常組織(P＜0.05)。采用ROC 曲線評估SPRR2A對肺鱗癌的識別能力,AUC=89.9%,敏感度81.08%,特異度93.88%,P＜0.05,提示SPRR2A 可能是診斷肺鱗癌的分子標志物,見圖1～3。

圖1 SPRR2A 在不同腫瘤組織中的表達

圖2 SPRR2A 在肺鱗癌組織和癌旁正常組織表達

圖3 SPRR2A 對于肺鱗癌的診斷價值

2.2 組織學驗證 成都醫學院第一附屬醫院外科手術獲得肺鱗癌組織和癌旁正常組織40 例(1∶1),通過RT-qPCR 和WB試驗分析肺癌患者肺鱗癌組織和癌旁正常組織SPRR2A m RNA 和SPRR2A 蛋白表達。肺鱗癌組織中的SPRR2A m RNA 和SPRR2A 蛋白的表達均高于癌旁正常組織,差異有統計學意義 (P＜0.01),見表1,圖4。

表1 2組SPRR2A 基因表達 ()

表1 2組SPRR2A 基因表達 ()

圖4 肺鱗癌組織和癌旁正常組織中SPRR2A 蛋白表達A:蛋白電泳圖;1為癌旁正常組織,2為肺鱗癌組織;B 柱狀圖

2.3 肺癌細胞系驗證 將4株肺鱗癌細胞系SKMES-1、H226、HB-99、H520與正常人肺上皮細胞系BEAS-2B 進行對比。在4種細胞系中有3株SK-MES-1,H226,HB-99的SPRR2A m RNA 和SPRR2A 蛋白表達水平均高于正常人的肺上皮細胞系BEAS-2B,差異有統計學意義 (均P＜0.05)。見表2,圖5。

表2 不同肺癌細胞系中SPRR2A 基因的表達 ()

表2 不同肺癌細胞系中SPRR2A 基因的表達 ()

圖5 各種肺癌細胞株SPRR2A 蛋白表達情況 A:蛋白電泳圖;3為BEAS-2B;4為H520;5為H226;6為SK-MES-1;7為HB-99;B:柱狀圖

2.4 SPRR2A 差異基因及所富集的KEGG 通路本研究將TCGA 數據庫中的SPRR2A 高表達肺鱗癌243例與SPRR2A 低表達243例進行比較,共篩選出348個下調的基因和180個上調的基因,排列前10 的差異基因的熱圖,所有基因的火山圖,差異基因主要富集于細胞黏附分子(FDR=0.021,P＜0.05)和囊泡運輸的相互作用 (FDR=0.018,P＜0.05)兩個信號通路。見圖6～8。提示SPRR2A 可能和腫瘤的侵襲和遷移有關。

圖6 差異基因的熱圖

圖7 差異基因的火山圖

圖8 差異基因富集的信號通路 A 為細胞黏附分子通路;B為囊泡運輸相互作用通路

2.5 SPRR2A 表達與患者預后關系 結果顯示,SPRR2A m RNA 水平對肺鱗癌患者的總生存期和無疾病進展生存期均有顯著影響;與低表達組相比,SPRR2A m RNA 高表達組的肺鱗癌患者總生存時間和無疾病進展生存期均短于低表達組(HR=1.60,P＜0.05;HR=1.69,P＜0.05)。見圖9。

圖9 SPRR2A 的表達與患者預后的關系

2.5 Transwell實驗結果 GSEA 通路顯示,高表達SPRR2A 樣本的差異基因主要富集于和腫瘤侵襲和遷移相關的通路上,本研究選取SPRR2A表達最明顯的細胞株SK-MES-1 作為研究對象,敲減了SPRR2A 基因 (shRNA SRRP2A 組),Western blot檢測結果顯示,敲減的SK-MES-1細胞系(sh RNASPRR2 A組)SPRR2 A表達下調,提示敲減SPRR2A 成功。因此,本實驗采用對敲減了SPRR2A 基因的SK-MES-1細胞,進行侵襲和遷移實驗。shRNA-SPRR2A 組遷移的細胞數明顯低于sh RNA 陰性對照組,侵襲的細胞數也低于sh RNA 陰性對照組 (P值均＜0.05),見表3 和圖9～11。

表3 兩組侵襲和遷移試驗結果比較 ()

表3 兩組侵襲和遷移試驗結果比較 ()

圖10 Western blot檢測敲減SPRR2A 結果 A:蛋白電泳圖;B:柱狀圖;1為shRNA SRRP2A 組;2 為shRNA 陰性對照組

圖11 敲減SPRR2A 對肺鱗癌細胞的遷移和侵襲的影響 A:shRNA 陰性對照組SK-MES-1細胞遷移檢測結果;B:sh RNA SRRP2A 組SK-MES-1細胞遷移檢測結果;C:shRNA 陰性對照組SK-MES-1細胞侵襲檢測結果;D:shRNA SRRP2A 組SK-MES-1細胞侵襲檢測結果

3 討論

脯氨酸小蛋白 (small proline-rich proteins,SPRR)是一個基因家族,這個基因家族由2 個SPRR1基因、7個SPRR2基因、1個SPRR3基因共同組成,這些基因主要是一些分布位置極為相近且基因序列高度相似的小基因,參與組織器官的上皮細胞的分化,并且和屏障系統密切相關[10]。研究表明SPRR2A 在肺、胃腸道、前列腺、膽管和乳腺組織中呈現差異性表達,可以通過活性氧干擾細胞遷移,影響組織修復及傷口愈合等[11]。對于SPRR2A 在腫瘤中的研究較少,主要集中在消化道腫瘤及頭頸部腫瘤的研究中,Fang等[12]研究報告表明SPRR2A 在舌鱗狀細胞癌中低表達,誘導過表達SPRR2A 可以輕微促進腫瘤細胞的增殖,但減少了舌鱗狀細胞癌的遠處轉移。但在許曉明等[10]研究的胃癌細胞中,SPRR2A 可以促進癌組織細胞周圍上皮細胞向間質細胞轉變 (epithelial mesenchymal transition,EMT)的形成,進而促進胃癌細胞的轉移和浸潤。同一個基因在不同的腫瘤組織中的表達具有特異性,而SPRR2A 在肺鱗癌中的表達與預后的關系、功能以及涉及的具體分子機制并未完全清楚。

本研究結果顯示,在TCGA 數據庫中,與癌旁正常組織比較,SPRR2A mRNA 在肺鱗癌組織中表達水平上調,上述結果得到了臨床標本和不同分化能力的肺鱗癌細胞株的驗證。在ROC 曲線分析中,結果顯示AUC 89.9%,敏感度81.08%,特異度93.88%,提示SPRR2A 基因具有一定的鑒別肺鱗癌的診斷能力,可以作為診斷肺鱗癌的一個可靠的分子標志物。通過R 軟件行生存預后分析得出SPRR2A 高表達的肺鱗癌患者總生存時間更短,而且較高的SPRR2A 水平提示較低的無復發生存率,說明SPRR2A 基因在肺鱗癌中可能起到促癌作用。為了進一步探究SPRR2A 在肺鱗癌中的分子機制,將高表達和低表達SPRR2A 的患者的基因圖譜進行差異基因分析,共篩選出348個下調的基因和180個上調的基因,差異基因主要富集于細胞黏附分子和囊泡運輸的相互作用兩個信號通路。

各類黏附分子的平衡表達對于維持上皮細胞正常結構和功能穩態具有重要意義,細胞間的連接缺失是上皮間質轉化的關鍵環節[13]。肺上皮細胞具有極性,上皮細胞與上皮細胞之間、細胞與基底之間存在多種跨膜的黏附蛋白,上皮細胞依靠這些細胞黏附分子以及由黏附分子穿插組裝成的各類細胞連接共同維持上皮結構和功能的動態穩定[14]。細胞外囊泡是由多種細胞釋放到胞外空間的一類具有雙層膜結構的囊泡,其中裝載有DNA、RNA、蛋白質、脂質等其他小分子物質,可以在細胞通訊中發揮信號傳遞的作用[15]。研究發現,胞外囊泡在不同的組織中具有高度異質性,參與了腫瘤的發生、轉移及免疫逃逸[16]。因此本研究推測高表達SPRR2A 的患者預后更差,可能跟SPRR2A 參與了生物信息分析所得出的細胞黏附分子和囊泡運輸的相互作用通路有關,這兩條通路影響肺鱗癌的遷移和侵襲,高表達SPRR2A 的肺鱗癌患者可能更容易發生轉移。為了驗證這一猜想,本研究通過構建轉染sh RNA-SPRR2A 質粒的SK-MES-1細胞,進一步證明了敲減SPRR2A 后,肺鱗癌SK-MES-1細胞的遷移和侵襲都受到了抑制。

Xu 等[8]在胃癌的研究中顯示結合血清SPRR2A 濃度與癌胚抗原濃度的檢測有助于診斷早期胃癌的發生,患者血清SPRR2A 水平與淋巴結轉移和TNM 分期密切相關。這與本實驗研究結果有一定的一致性。Mizuguchi等[17]研究報告指出在膽管癌中,SPRR2A 誘導的上皮間質轉化增加了膽管癌的局部侵襲性,這可能與SPRR2A 參與了結合鋅指蛋白1和羧基末端結合蛋白,三者形成了蛋白復合物結合在miR-200c/141 的啟動子上,導致了miR-200c/141 轉錄的協同抑制作用有關。目前有研究認為SPRR2A 促進細胞的遷移和上皮間質轉化有關。在膽管癌細胞中,過表達SPRR2A 會導致細胞侵襲性增加,SPRR2A 促進EMT 這一過程,主要與信號轉導子和轉錄激活子3/表皮生長因子受體/酪氨酸激酶受體2軸激活有關[18]。但目前關于SPRR2A 在肺鱗癌中的具體分子機制研究很少,SPRR2A 在肺鱗癌的發生過程也有可能通過促進癌組織細胞周圍EMT 形成,促進肺鱗癌的轉移和浸潤,這與本研究中高、低表達SPRR2A 組的差異基因主要富集在黏附分子信號通路相一致,其具體的直接作用機制需進一步的實驗驗證。

綜上所述,SPRR2A 在肺鱗癌中表達升高,高表達SPRR2A 的患者預后更差,可能與SPRR2A 影響肺鱗癌細胞的侵襲和遷移有關,但具體調控的基因和分子機制尚待進一步研究。本文結合生物信息分析初步探討SPRR2A 與肺鱗癌侵襲和遷移的關系,有望作為臨床上治療肺鱗癌的新靶點及生物標志物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突