基于Web of Science數據庫禾草內生真菌生物堿論文計量統計分析

張若晨，李濤，姚祥，陳振江，李春杰*

（1.蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州730020；2.江蘇省中國科學院植物研究所，南京中山植物園，江蘇 南京210014）

禾草內生真菌是指在禾草中度過全部或大部分生命周期，而禾草不顯示外部癥狀的一類真菌［1］。但是可通過組織學方法從嚴格表面消毒的植物組織中分離出內生真菌菌株［2-3］。關于植物內生微生物以及植物內生菌國際上已早有記載，但現代植物內生真菌研究的基礎，形成于20世紀70年代林木內生真菌和禾本科植物內生真菌研究［4-6］。隨著研究領域的不斷拓寬和研究方法的不斷深入，禾草內生真菌的研究進入了快速發展階段，其范疇不斷擴大，在農業和醫藥領域中都具有很大的應用潛力，而且禾草內生真菌的研究內涵也在不斷豐富，發揮了重要的生態和生理作用及其可作為潛在的生防資源和外源基因的載體［7-8］，這些使得禾草內生真菌已逐漸成為國內外研究的熱點［9］。近幾十年研究指出大部分禾本科植物均存在內生真菌［7］，禾草內生真菌可以促進宿主植物生長、增強植物的光合作用、合成植物激素［10］，除此之外禾草內生真菌還可以提高寄主植物的各種抗逆性，例如耐旱性［11］、耐鹽性［12］、耐寒性［13］、抗病性［14］，并且能夠促進禾本科植物吸收營養物質、還可以提高牧草產量［15］。

禾草內生真菌與宿主植物形成互惠互利共生體，而且絕大多數的內生真菌在宿主植物內會產生生物堿，對于生物堿的研究最早可以追溯到1944年，人們發現羊采食了黑麥草（Lolium perenne）后會出現類似麥角中毒的癥狀，Cunningham 等［16］報道稱，引起家畜出現中毒癥狀的多年生黑麥草并沒有被任何病害所侵染的跡象，此后又有多篇高羊茅（Festuca arundinacea）導致家畜中毒的報道問世［17］。20世紀60年代，人們從黑麥草和高羊茅等禾草中分離出了多種生物堿［18］。但是此后幾年內國際上關于禾草內生真菌共生體使家畜中毒的原因與機制等方面的研究與報道較少［19］。直到20世紀70年代，人們又發現了感染內生真菌的一些禾本科植物如高羊茅、黑麥草等會引起牛、羊等家畜中毒，因此，對禾草內生真菌和生物堿生物學作用方面的研究逐漸引起大家的重視［20］。1981年報道了綿羊黑麥草結節病的暴發與多年生黑麥草中的兩種神經毒素有關，這兩種黑麥草中的代謝產物被分別命名為Lolitrem A 和Lolitrem B［21］。之后，新西蘭與美國先后報道了高羊茅與黑麥草中內生真菌產生的數種生物堿，他們對內生真菌生物堿的研究大都集中在生物堿的分離、純化、鑒別以及分子結構等方面［18］。20世紀初，Li等［22］發現，在中國北部廣泛分布著一種對家畜具有毒性和麻醉性的禾草，即醉馬草（Achnatherum inebrians），且他們發現醉馬草對動物的毒性由甘肅內生真菌（Epichlo? gansuensis）的代謝產物導致。2006年，Song 等［23］發現，被內生真菌感染的醉馬草中含有大量的麥角堿類生物堿，包括麥角堿和麥角新堿。2007年，Zhang 等［24］發現，披堿草（Elymus dahuricus）內生真菌共生體可以產生波胺，且產堿量呈季節性變化，在10月最多，在6月幾乎不產生生物堿。2011年Zhang 等［25］研究了刈割頻率和刈割高度對于醉馬草產生生物堿含量的影響；同年他又發現在鹽脅迫或干旱脅迫下，醉馬草內生真菌共生體仍會保持較高的產堿量，且麥角新堿比麥角堿的產量高［26］。2014年，Zhang 等［27］又發現，麥角生物堿對動物平滑肌細胞具有細胞毒性作用，且生物堿濃度越大，對細胞生長的抑制作用就越強。2015年，Zhou 等［28］評估了溫度對3 種生態型中華羊茅（Festuca sinensis）麥角生物堿產量的影響，發現麥角堿和麥角新堿在短期的寒冷脅迫下會發生改變。2017年，Ekanayake 等［29］通過對高羊茅內生真菌共生體產生生物堿的基因組和代謝特征的研究，指出了通過DNA 分析發現和初步鑒定的內生真菌，進行代謝驗證研究，這種方法可以提高產堿的速度和效率。2018年，Li 等［30］發現，白粉病和土壤水分條件顯著影響醉馬草內生真菌共生體的麥角堿產量。2019年，Lin 等［31］發現，季節變化和生態型對中華羊茅內生真菌共生體產堿量均有影響，且季節變化對生物堿濃度的影響比生態型更為顯著。2020年，Cagnano 等［32］對歐洲不同地點收集的受Epichlo?屬內生真菌感染的禾本科植物進行基因分型測序（genotyping-by-sequencing），深入研究了寄主和內生真菌的遺傳結構及其相互作用，結果表明，在植物和內生真菌亞群中，洛林生物堿和菌絲體生物量的濃度是相關的，并且存在個體差異。此外，Cagnano 等［32］還對基因分型測序是否值得用于Epichlo?屬內生真菌-禾草共生體做出了探討，發現最大的限制是內生真菌對植物閱讀的數量不成比例地低，因為真菌生物量遠遠低于植物生物量。同年，Cagnano 等［33］研究發現，近紅外光譜法和化學計量學的結合使用可以定量檢測禾草內生真菌共生體中的洛林生物堿含量和菌絲生物量。2019年，Caradus 等［34］綜述了麥角堿濃度對新西蘭牧草和反芻動物放牧草地的影響，論證了人工接種可以得到不表達麥角纈氨酸但仍產生麥角堿的內生真菌菌株，也就是對放牧動物低毒性且具有抗蟲性的禾草內生真菌共生體。

目前人們發現的與禾草內生真菌有關的生物堿已有數10 種，例如，從黑麥草和草甸羊茅（Festuca pratensis）中分離的內生真菌分別可產生震顫素（Lolitrem B）［35］和黑麥草堿（Lolines）［36］，從醉馬草中分離的甘肅內生真菌可以產生麥角酰胺和麥角新堿［37］。這些生物堿主要可以分為4 類，分別是吡咯并吡嗪類，代表物為波胺；麥角堿類，代表物有麥角堿和麥角新堿；吲哚雙萜類，代表物有震顫素；以及飽和吡咯化合物，代表物主要是黑麥草堿［18］。

大多數生物堿對生物都具有毒性，只有波胺對哺乳動物沒有毒性，而其中毒性最強的是麥角堿類和吲哚雙萜類生物堿［38］。被內生真菌感染的高羊茅、黑麥草與醉馬草通常會產生多種麥角堿，它不僅使所采食的動物中毒，還可改變動物的生理指標（體重、體溫、血液中激素含量、肌肉纖維產量等），嚴重時會導致動物死亡。其中麥角新堿是導致家畜中毒的重要毒素，主要是因為麥角新堿對動物平滑肌細胞具有細胞毒性作用［27］。另一方面，雖然生物堿普遍具有毒性，但有研究表明，禾草內生真菌產生的生物堿可以增強寄主的抗逆性，如抗蟲［39］、抗干旱等［40-42］。同時生物堿也阻止了家畜和草食性野生動物等對禾草的采食，起到了對物種多樣性的保護作用［43］。而且生物堿還可增加寄主植物對于某些線蟲的抵抗能力，在帶有內生真菌的高羊茅生長的土壤內，多種線蟲的群體數量均明顯低于不帶有內生真菌禾草生長的土壤［44］。因此，在人為的調控下，有望將各種優勢繼續擴大，使它在生物農業方面大放異彩。

我國植物內生真菌生物堿的研究始于20世紀90年代，并且在近年內對內生真菌生物堿展開一系列研究，發表了大量的文章，但是國內對于內生真菌生物堿的研究大多集中于藥用植物和谷類作物［18］，對于禾本科植物內生真菌共生體產生生物堿的研究卻相對較少，相反國外近年來十分關注對禾本科植物以及Epichlo?屬內生真菌的研究。因此，對于這一領域文獻的計量統計分析，將有利于了解其發展狀況。鑒于目前國內沒有禾草內生真菌生物堿相關的文獻計量分析，因此，本研究對2000-2019年這20年間Web of Science 數據庫中的禾草內生真菌生物堿文章進行計量分析，旨在了解當前關于國際上禾草內生真菌生物堿研究的現狀和發展趨勢，為我國從事禾草內生真菌生物堿研究的各位科技工作者提供參考。

1 材料與方法

文獻來自Web of Science 數據庫（包括Web of Science 核心合集、BIOSISI Previews、KCI-Korean Journal Database、Russian Science Citation Index、sciELO Citation Index 5 個庫），采用基本檢索的方式，以“Epichlo?，alkaloids”或者“Neotyphodium，alkaloids”為關鍵詞，檢索該數據庫內2000-2019年間與禾草內生真菌生物堿有關的文獻數據記錄。經過篩選以后得到646 篇相關文獻。本研究將對這些文獻進行統計分析，主要分析指標有：發文所屬國家、發文數量歷年變化趨勢、文章研究方向、發文所屬機構、文獻來源、文獻被引用頻次以及H 因子（hindex）等。其中H 因子是一個評價學術成就的新指標，它是指一名科研人員（國家或機構）至多有h 篇論文分別被引用了至少h 次。h 指數越高，則表明論文影響力越大。而文獻被引頻次則客觀地反映了總體被使用和受重視的程度。

2 結果與分析

2.1 國際發文數量與所屬國家分析

2000-2019年，Web of Science 數據庫收錄與禾草內生真菌生物堿研究相關的文獻總計646 篇，統計了發文所屬國家，共有36 個。然后，選取了發文數量前10 的國家進行分析（表1）。發現在發文數量與h-index 方面，美國、新西蘭兩國大幅領先其他國家，說明這兩國在禾草內生真菌生物堿領域的研究進展與影響力處于國際頂尖水平。而平均被引次數卻是中國（包括檢索結果中的“China”與“Peoples Republic of China”）、德國和加拿大最多，說明中國、德國與加拿大也是關于禾草內生真菌生物堿研究的主要力量。

表1 2000-2019年發表禾草內生真菌生物堿文章數量前10 國家Table 1 Top 10 countries publishing articles on alkaloids of grass endophytic fungi from 2000 to 2019

相較于美國、新西蘭等國家，我國關于禾草內生真菌生物堿的研究開始較晚，21世紀以后我國才開始此方面的研究，但是我國內生真菌生物堿的研究發展迅速，尤其是2011年后，相關文章數量明顯增加（圖1）。國內最早關于禾草內生真菌生物堿的介紹是Tan 等［45］2001年發表在Natural Product Reports 期刊（農林一區，IF2018=11.88）的《Endophytes：A rich source of functional metabolites》。該文章中主要介紹了3 種禾草內生真菌生物堿的分子結構、毒性及其來源，分別是胺類與酰胺類生物堿，吲哚衍生物類生物堿（這類生物堿對昆蟲和哺乳動物有毒），以及吡咯烷類生物堿，以上生物堿均產生于內生真菌感染的禾草中，其中有些生物堿可以作為殺蟲劑，但對哺乳動物的毒性較小［45］。此后數年，Tan 及其團隊未對禾草內生真菌生物堿進行繼續研究。而我國禾草內生真菌生物堿的研究領域內，南志標院士團隊研究最為系統深入，發文量最多，推動了國內禾草內生真菌生物堿的研究，使這方面的研究從此進入快速發展的階段。

圖1 2000-2019年前三國家發文量年動態Fig.1 The dynamic of top 3 countries publishing articles on grass endophytic fungi during 2000 to 2019

2.2 相關發表文章所屬機構分析

對檢索出的關于內生真菌生物堿研究的646 篇科技論文，按照其所屬科研機構進行分類，然后選取發文量前十的機構進行統計分析（表2），目前對于禾草內生真菌生物堿研究主要集中在高校和科研院所，其中肯塔基大學、西弗吉尼亞大學、梅西大學與蘭州大學等對于內生真菌生物堿的研究較為深入，美國農業部與新西蘭農業部對于內生真菌生物堿的研究較為重視。而且發文數量最多的幾個機構分別屬于美國、新西蘭和中國，說明這3 個國家在該領域的研究處于世界前列。

表2 2000-2019年禾草內生真菌生物堿文章數量前10 機構Table 2 Top 10 institutions of publishing articles on alkaloids of grass endophytic fungi from 2000 to 2019

隨后本研究對國內的33 篇生物堿相關文章進行統計分析（圖2），發現國內對于禾草內生真菌生物堿的研究主要集中在高校，其中蘭州大學對禾草內生真菌生物堿的研究最為深入和系統，共發表了23 篇相關文章，研究方向主要包括生物堿的提取和檢測方法、生物堿的合成機理、生物堿對家畜的毒性、生物堿的組織分布、季節變化以及生物堿對共生體的生理生態作用等。20世紀國際上已對禾草內生真菌生物堿展開一系列的研究，研究報道主要集中在羊茅屬禾草［46-48］、多年生黑麥草［1］以及睡眠草（Achnatherum robustum）［49］等。而21世紀以來，南志標院士團隊擴展了對禾草內生真菌生物堿的研究范圍，開始對醉馬草［50-51］、披堿草［52］、野大麥（Hordeum brevisubulatum）［12，53］和中華羊茅［28，31］中的生物堿進行研究。

圖2 2000-2019年國內機構發文情況Fig.2 The dynamic of domestic institutions publishing articles on grass endophytic fungi during 2000 to 2019

2.3 我國與國際發表文章的研究方向對比分析

目前關于內生真菌生物堿的研究已經延伸到了各個行業，包括植物科學、微生物學、化學、農業科學、基因學、病理與藥理學等幾十個研究方向，現在對檢索出的關于內生真菌生物堿研究的646 篇科技論文，按照其研究方向進行分類（由于出現學科交叉現象，所以各個分類文章相加大于總數），選取發文量前10 的研究領域進行統計分析（表3）。其中關于植物科學（plant science）方面的論文數量最多，有526 篇，占總發文量的81.42%。而且禾草內生真菌生物堿相關的研究涉及范圍非常廣，主要集中在農學、環境生態學、微生物學、生物化學與分子生物學等研究領域。

表3 2000-2019年國際禾草內生真菌生物堿研究方向Table 3 Research areas on alkaloids of grass endophyte fungi from 2000 to 2019

而我國相關領域的33 篇文章中，最多的研究方向也是植物科學，有29 篇與之相關。我國關于內生真菌生物堿的研究主要集中在真菌學、生物化學與分子生物學、農學、環境生態學等領域，與國際目前的總體研究趨勢一致。

2.4 我國相關文章的被引用情況統計分析

我國禾草內生真菌生物堿相關文章被引頻次（包括自引）為67.67，遠高于國際平均水平（24.63），說明我國的文章在國內外具有較高認可度。因此，本部分統計了我國被引用頻次最高的6 篇文章（表4），并對其進行分析。其中《Endophytes：A rich source of functional metabolites》被引用的次數最多，有922 次，該研究主要介紹了內生真菌代謝物與生物堿的生物學特性，指出內生真菌是一種豐富可靠的生物活性和化學新化合物來源，具有巨大的藥用和農業潛力，除了介紹禾草內生真菌生物堿以外，還介紹了其他多種內生真菌代謝物，因此被學者們廣泛引用。而且從表中可以看出國內被引用前幾的文章主要是介紹生物堿的生物學特征，生態作用以及影響禾草植物產堿量的因素。

表4 2000-2019年我國禾草內生真菌生物堿被引頻次最高的6 篇文章Table 4 Top 6 most cited articles in the field of alkaloids of grass endophyte fungi in China from 2000 to 2019

2.5 我國相關文章的文獻來源統計分析

收錄我國的33 篇相關文章的期刊一共有25 個，再次說明了我國目前關于內生真菌生物堿的研究涉足領域十分廣泛。目前國內發表在Natural Product Reports 的兩篇文章，即《Endophytes：A rich source of functional metabolites》和《Biology and chemistry of endophytes》，是中國學者以第一作者的身份在禾草內生真菌生物堿領域所發表的影響因子最高的兩篇文章，影響因子為11.876。收錄我國該領域內文章最多的期刊是Frontiers in Microbiology，收錄了3 篇文章。我國禾草內生真菌生物堿文章所發表的期刊影響因子多在2～4，影響因子在0～2 次之，而影響因子在4～6 以及影響因子＞6 的文章則相對較少（圖3）。對收錄國內禾草內生真菌生物堿文章的期刊進一步分析發現，發表我國文章超過一篇的期刊有7 個（表5），說明隨著國內對于生物堿研究的不斷深入，我國文章所發表的期刊水平逐年提高，陸續有文章發表于Journal of Agricultural and Food Chemistry（農林一區）、Natural Product Reports（化學一區）等高水平期刊。

圖3 2000-2019年我國禾草內生真菌論文影響因子分布Fig.3 Distribution of impact factors of the articles on grass endophyte fungi published by Chinese scientists during 2000 to 2019

表5 2000—2019年我國內生真菌生物堿文章期刊（發表文章超過一篇）分布Table 5 The distribution of journals（publishing more than one article）on alkaloids of grass endophyte fungi in China during 2000 to 2019

3 總結與展望

目前由于真菌學、微生物學、分子生物學和基因遺傳學的快速發展，以及近年來植物內生真菌生物堿在農業系統中的作用越來越受到重視，使得人們對于禾草內生真菌生物堿的研究取得了突破性的進展。比如，生物堿使宿主產生抗性的機制；不同禾草內生真菌共生體產生生物堿的類型及其對家畜的毒性作用；影響生物堿在植物中分布特點及濃度的因素；生物堿的人工合成途徑等方面。

我國的禾草內生真菌生物堿研究已取得很大的進步，但國內的研究大都從21世紀初才開始，因此，關于禾草內生真菌生物堿的研究仍與美國、新西蘭等國家存在差距。所以提出以下幾方面建議，望研究者們可以克服困難，使我國禾草內生真菌生物堿的研究更加系統完善。

一、現階段國內的研究雖然拓寬了對禾草內生真菌生物堿的研究領域，但是關于生物堿的基礎研究相較于國外仍然比較薄弱，因此，研究者應對生物堿基礎方面進行更為深入的研究。

目前國內生物堿使宿主植物產生抗性機制的研究大多是在受控環境中進行，試驗結果可能只能證明寄主某種抗性的一般趨勢，田間的情況可能與實驗室中的記錄存在差異。例如，抗蟲性試驗過程中模擬的植物施肥、土壤水分和溫度條件都是對植物生長最有利的，這些因素都可能影響禾草內生真菌共生體與昆蟲的相互作用結果，使試驗結果不能準確反映田間禾草內生菌共生體對昆蟲的影響［54］。因此，建議下一階段重點研究在不受控制的真實田間環境下，探究生物堿對于宿主植物產生抗性的影響。

國內的相關研究證明環境溫度和生物堿的劑量會影響生物堿中毒的發生，以及洛林生物堿是通過阻斷鉀離子與神經膜受體相互作用的通道致使家畜中毒［55］。但是生物堿對動物的毒性作用尚未完全清楚，而且對目前已知的4 種生物堿的致毒機理尚無更深入的研究。因此，接下來的此類研究應該著重從生物堿致毒機理方面入手，例如，從植物和動物組織中提取出生物堿進行離體研究，這可能為進一步揭示其致毒機理提供更多研究線索，為以后內生真菌的合理應用提供理論依據。

國內的研究者雖然進行了一系列影響植物中生物堿含量因素的研究（包括鹽脅迫、干旱脅迫、刈割頻率與刈割高度、寒冷脅迫以及季節變化的影響），但都是初步探討，建議對這方面進行更多的研究，得到更為深入和有益的結果，為我國研究者進一步探索禾草內生真菌代謝產物奠定基礎。

二、通過對國內近20年的禾草內生真菌生物堿研究文章進行分析，發現國內對于生物堿的定性和定量分析都是用高效液相色譜法或氣相色譜法進行測定，這些方法測定結果固然準確，但是時間成本和人工成本相對較高。由于近紅外光譜已經廣泛用于牧草的常規分析，因此，國際上有研究建立了一種對洛林生物堿進行快速檢測和定量分析的新型方法，此方法基于近紅外光譜法（near infrared spectroscopy，NIRS），加上改進的偏最小二乘法，利用獲得的近紅外光譜建立了植物真菌生物量和生物堿含量的定量預測方程，最終定量計算禾草內生真菌樣品中的洛林生物堿含量和菌絲生物量［33］。而且為篩選和分離得到自然產生的動物友好型菌株，以便日后再次接種優良品種，研究者必須對禾草內生真菌共生體進行大規模篩選，并對菌株進行特征描述和生物堿測定。相比國內研究大多采用的全基因組測序的方法，國外有研究采用的基因分型測序（genotyping-by-sequencing），其成本更低，更適合于大量的個體［32］。有關禾草內生真菌生物堿鑒定、定量分析、基因測序以及增加產量等方面的新技術和新方法的應用，減少了研究的成本，同時提高了效率。但是在目前統計的國內文獻中，這些新技術和新方法很少被研究，因此建議國內研究者在加強對生物堿基礎研究的同時，適當引入新的試驗技術和研究方法，以更加明確內生真菌和宿主禾草之間的相互作用，加速人工接種以提高生物堿產量方面的研究，并為基因組關聯的研究鋪平道路。

三、近年來為提高生物堿的產量，使其更好地應用于農業和醫藥等領域，使得生物堿的生物合成和調控網絡逐漸成為該領域研究和關注的重點。目前在生物堿合成方面的研究雖有進展，但是對于生物堿的生物學特性仍需更加深入的研究。由于生物堿的成分復雜，分離純化的成本高，因此，有必要利用新興的合成生物學研究人工合成的方法。目前現有的細胞工廠中已經構建了麥角生物堿的部分生物合成途徑，并產生了相應的中間產物。但是這些中間產物產率很低而且與最終產物相差甚遠。所以進一步優化細胞工廠途徑、基因組編輯、提高工程宿主的酶活性和適應性、增加前體供應等是提高產量的關鍵［56］。我國亟待利用代謝工程技術實現生物堿的高效、大規模生產。

四、關于內生真菌生物堿的研究已經延伸到了各個行業，真菌學與其他學科間的相互協同與交叉研究已是目前研究的潮流與趨勢，通過基因遺傳學和植物科學的研究明確內生真菌與寄主植物的相互關系，推動了生物堿的發展。因此，建議國內未來的研究調查增加生物堿或產生生物堿的遺傳潛力的測試，評估Epichlo?和相關內生真菌的農業生態意義，加強生物堿與其他學科之間的共同研究。