草莓組織培養(yǎng)育苗技術(shù)體系優(yōu)化

馬磊 路遠(yuǎn) 陳小文 劉艷嬌 王海生

摘? ? 要：為進(jìn)一步優(yōu)化草莓組織培養(yǎng)育苗技術(shù)體系，本試驗以日光溫室內(nèi)草莓植株匍匐莖為原材料，研究外植體的消毒接種、啟動培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、馴化移栽等關(guān)鍵技術(shù)。結(jié)果表明，最佳滅菌處理為75%酒精消毒20 s，0.1%HgCl2消毒3 min，成活率可達(dá)97.5%;最佳增殖培養(yǎng)基為MS+0.3 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IBA，增殖系數(shù)3.6，平均株高3.66 cm;最佳生根培養(yǎng)基為MS（大量元素硝酸鉀，硝酸銨減半）+25g·L-1蔗糖，生根率100%，平均根長3.65 cm，平均生根數(shù)5.7;最佳移栽基質(zhì)配比為草炭土∶珍珠巖∶蛭石=3∶1∶1，成活率為98%。草莓組培育苗加快繁殖速度，增加繁殖系數(shù)，對草莓產(chǎn)業(yè)化育苗提供一定的參考價值。

關(guān)鍵詞：草莓;組織培養(yǎng);莖尖;馴化;育苗

中圖分類號：S668.4? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.10.013

Optimization of Tissue Culture System of Strawberry

MA lei1，LU Yuan1，CHEN Xiaowen2，LIU Yanjiao2，WANG Haisheng1

（1. Hebei Fuxiang Seed Technology Co.， Ltd.， Xingtai， Hebei 054000， China; 2.Beijing Zhongnongfutong Horticulture Co.， Ltd.， Beijing 100000， China）

Abstract：In order to further optimize the strawberry tissue culture seedling technology system， the experiment was conducted with the stolon of strawberry in solar greenhouse， the key technologies of explant disinfection and inoculation， start-up culture， subculture， rooting culture， domestication and transplanting were studied.The results showed that the disinfection of the strawberry stem tips with 75% alcohol for 20 s and 0.1% HgCl2 for 3 min were optimal and could reach a survival rate of the tissue up to 97.5%. The optimal medium for proliferation was MS+0.3 mg·L-1? 6-BA + 0.1 mg·L-1IBA， the proliferation coefficient was 3.6， and the average plant height was 3.66 cm. The optimal medium for rooting medium was MS （1/2KNO3 and 1/2NH4NO3）+25g·L-1sucrose， the rooting rate was 100%， the average root length was 3.65 cm， and the average rooting number was 5.7. The optimal basic medium was peat∶perlite∶vermiculite at 3∶1∶1 ratio that provided a seedling survival rate of 98%. Comprehensively，strawberry tissue culture could accelerate the propagation speed and increase the propagation coefficient，which provides a certain reference value for strawberry industrialization.

Key words： strawberry; tissue culture; stem tip; domestication; seedling breeding

草莓（Fragaria ananassa Duch.），薔薇科多年生草本植物，被譽為“水果皇后”，其生長周期短、結(jié)果快、成熟早、管理加工容易，在漿果類水果中，栽培面積和產(chǎn)量均占較大比例[1]，其栽培面積僅低于葡萄。據(jù)統(tǒng)計，截止2018年，我國草莓種植面積超17萬km2[2]，種苗需求量巨大，草莓的繁殖方式成為日漸關(guān)注的對象。草莓育苗方法主要是匍匐莖繁殖，但該方法導(dǎo)致積累病毒多、植株矮小、繁殖系數(shù)低、產(chǎn)量較低且品種退化嚴(yán)重。隨著我國農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，草莓的繁殖方式也在不斷完善，目前通過組織培養(yǎng)技術(shù)繁育草莓苗，可以快速獲得大量的草莓種苗，其品質(zhì)高、植株生長快、繁殖系數(shù)高、病蟲害少且果實的商品價值和經(jīng)濟價值較高[3]。因此，系統(tǒng)優(yōu)化草莓高效高產(chǎn)的組培育苗技術(shù)，對草莓優(yōu)質(zhì)品種繁育，工廠化種苗生產(chǎn)意義重大。本研究通過優(yōu)化草莓組織培養(yǎng)育苗技術(shù)體系，為草莓種苗快速繁殖提供技術(shù)支撐，以滿足生產(chǎn)用戶的需要，也為草莓組培苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為當(dāng)年生的草莓幼嫩匍匐莖的莖尖，采集于河北省邢臺市南和區(qū)南和農(nóng)業(yè)嘉年華草莓日光溫室，采集時間在3—5月。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的消毒 匍匐莖清洗：流水沖洗3 min，洗潔精浸泡3 min，輕輕振蕩，流水沖洗30 min;加入吐溫80（乳化劑T-80）成品浸泡2 min，流水沖洗30 min;轉(zhuǎn)至無菌操作臺，滅菌的去離子水清洗2次，75%酒精清洗，0.1%HgCl2清洗，滅菌的去離子水清洗4次。根據(jù)酒精和HgCl2的清洗時間設(shè)置6個處理（表1）。

1.2.2 啟動培養(yǎng) 剝?nèi)∏o尖：將洗凈的匍匐莖放至高溫滅菌濾紙上，在顯微鏡下用解剖針剝開幼葉，剝出0.3 mm左右的莖尖放到培養(yǎng)基中，每瓶2株，每組接種20瓶，莖尖培養(yǎng)采用MS培養(yǎng)基，6-BA 0.3mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1，瓊脂5.8 g·L-1，蔗糖25 g·L-1，pH值調(diào)至5.8。

啟動培養(yǎng)條件：前3 d暗培養(yǎng)，做遮光處理，3 d后進(jìn)行光照，光照時長12 h·d-1，光照強度2 500 Lx，溫度設(shè)置（23±2） ℃。

1.2.3 繼代培養(yǎng) 本試驗以誘導(dǎo)出的草莓組培不定芽為試驗材料，待生長到4～5個葉片后，大約60 d時進(jìn)行分割，接種到第一代繼代培養(yǎng)基中，每瓶3株，每組接種20瓶;后續(xù)繼代培養(yǎng)以第一代增殖培養(yǎng)60 d后的草莓組培苗為材料，每瓶3株，每組接種20瓶，采用MS培養(yǎng)基，瓊脂5.8 g·L-1，蔗糖25 g·L-1，pH值調(diào)至5.8。

第一代繼代培養(yǎng)基設(shè)置以下3個處理（表2），后續(xù)繼代培養(yǎng)設(shè)置以下6個處理（表3）。

繼代培養(yǎng)條件：光照時長12 h·d-1，光照強度2 500 Lx，溫度設(shè)置（23±2） ℃。

1.2.4 生根培養(yǎng) 本試驗以繼代培養(yǎng)組培苗為試驗材料，選取生長60 d以上，植株健壯的草莓苗，每瓶4株，接種20瓶，生根培養(yǎng)采用MS培養(yǎng)基，其中大量元素硝酸鉀、硝酸銨用量減半，其他營養(yǎng)物質(zhì)相同，觀察生根率，生根數(shù)和生根長度。

生根培養(yǎng)：MS培養(yǎng)基，瓊脂5.8 g·L-1，蔗糖25 g·L-1，硝酸鉀，硝酸銨用量減半，pH值調(diào)至5.8。

生根培養(yǎng)條件：光照時長12 h·d-1，光照強度2 500 Lx，溫度設(shè)置（23±2） ℃。

1.2.5 馴化移栽 草莓組培苗生根后直接移栽到大田成活率較低，需要經(jīng)過馴化移栽階段。選取根部健壯，根長3～5 cm，生根培養(yǎng)30 d以上的生根組培苗用于馴化移栽。將瓶苗放置溫度、濕度皆可調(diào)控的連棟溫室內(nèi)7 d，前3 d覆蓋遮陽網(wǎng)，避免強光照射，使草莓組培苗逐漸適應(yīng)自然光和溫室環(huán)境，第7天下午打開瓶蓋加入少量清水，第8天上午移栽至穴盤，移栽穴盤時將根部的培養(yǎng)基洗凈，放置0.1%多菌靈溶液中浸泡10 min，移栽至穴盤，蓋上保濕蓋保濕保溫，3 d將蓋子上的小孔打開小縫隙，5 d打開小孔一半，7 d打開整個小孔，10 d將保鮮蓋掀開，日光溫室生長1個月左右，可向大田移栽。

基質(zhì)成分比例為草炭土∶珍珠巖∶蛭石=3∶1∶1。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

文中數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時間對莖尖生長的影響

消毒和滅菌的時間不同，莖尖的成活率和污染率有一定的差異，選擇合適的消毒處理時間可以提高莖尖的成活率，圖1為吐溫和洗潔精浸泡、流水清洗后的匍匐莖。75%酒精和0.1% HgCl2的消毒時間對草莓莖尖生長的影響，試驗結(jié)果（培養(yǎng)60 d）詳見圖2。其中，A處理（圖2-A）葉片黃綠色，生長不均勻，葉片大小不一，莖顯紅色，植株生長較弱，成活率77.5%;B處理（圖2-B）葉片比較寬大，且不規(guī)整，葉片較少，植株矮小，成活率82.5%;C處理（圖2-C）葉片生長顏色不均勻，葉片較多，植株較矮小，成活率95%;D處理（圖2-D）植株生長茂盛，葉片多且規(guī)整，顏色翠綠，植株稍矮，成活率97.5%;E處理（圖2-E）莖顯紅色，葉片較少且顏色不均勻，植株較高，成活率87.5%;F處理（圖2-F）葉片稀少且比較嫩黃，植株較矮小，成活率85%。由此可見，D處理，即用75%酒精對草莓匍匐莖消毒20 s，0.1%HgCl2消毒3 min，效果佳，不定芽長勢好。

2.2 不同激素對草莓增殖階段的影響

不定芽的第一代轉(zhuǎn)接，采用3組激素濃度進(jìn)行對比，生長20 d后，如圖3所示，第①組生長較慢，葉片小，植株矮;第②組生長快，葉片較大，莖向上生長;第③組生長慢，幾乎沒有生長。由此可見，第一代轉(zhuǎn)接適宜采用較高濃度激素的培養(yǎng)基，但是濃度太高也會抑制不定芽的生長。

繼代培養(yǎng)以第一代增殖后的草莓組培苗為材料，接種到6組不同種類、不同濃度的激素培養(yǎng)基上，20，40，60 d后觀察草莓苗的增殖情況，如圖4所示，統(tǒng)計增殖數(shù)量，平均株高，計算增殖系數(shù)。由表4可知，不同激素處理對草莓的增殖系數(shù)影響不同，草莓增殖系數(shù)表現(xiàn)為⑤>②>⑥>①>③>④，其中⑤與③、④差異顯著，②、⑥與④差異顯著，其他處理間差異均不顯著;不同激素處理對草莓的株高影響也不同，草莓株高表現(xiàn)為③>⑥>⑤>②>①>④，其中③、⑥和⑤與①和④差異顯著。綜上可知，在草莓后續(xù)繼代增殖階段，處理⑤可作為最優(yōu)培養(yǎng)基配方。

2.3 生根階段的分析

生根培養(yǎng)30 d（圖5），草莓組培苗的根基本全部長出，從上述生根試驗結(jié)果計算得到以下數(shù)據(jù)，草莓組培苗平均生根數(shù)5.7條，生根率100%，平均根長3.65 cm，其中最長為6.3 cm，最短為0.9 cm。

2.4 馴化移栽

將上述生根培養(yǎng)30 d的草莓組培苗，在溫度和濕度可調(diào)控的連棟溫室內(nèi)馴化7 d，第7天下午打開瓶蓋并加入50 mL清水，第8天上午移栽至穴盤中，在保濕穴盤內(nèi)馴化10 d，然后再移栽到穴盤中培養(yǎng)25 d，如圖6所示，草莓苗的平均株高13 cm，成活率可達(dá)98%。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)過草莓組培育苗試驗可知，外植體消毒處理階段：用75%酒精對草莓匍匐莖外植體消毒20 s，0.1% HgCl2消毒3 min，效果最佳，不定芽長勢較好，這與吳正凱等[4]試驗結(jié)果相近，其匍匐莖處理為75%酒精消毒5～8 s，0.1% HgCl2消毒3 min。增殖培養(yǎng)階段：第一代轉(zhuǎn)接最終采用6-BA 0.6 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1的激素配比方案，第一代轉(zhuǎn)接組培苗在高濃度下增殖較好，植株生長健壯;后續(xù)繼代培養(yǎng)基為瓊脂5.8 g·L-1，蔗糖25 g·L-1，6-BA的最佳濃度為0.3 mg·L-1，IBA的最佳濃度為0.1 mg·L-1，pH值5.8，增殖系數(shù)3.6，大多增殖試驗都采用6-BA和IBA組合，劉刃等[5]用6-BA、IBA和GA組合，增殖系數(shù)較高，而且芽的長勢較好。生根培養(yǎng)階段：瓊脂5.8 g·L-1，蔗糖25 g·L-1，其中MS培養(yǎng)基中大量元素硝酸鉀、硝酸銨用量減半，其他營養(yǎng)物質(zhì)不變，生根率100%，平均生根5.7條，平均根長3.65 cm，大多草莓生根培養(yǎng)添加少量的植物激素，董敬超[6]研究的紅顏草莓生根培養(yǎng)激素是NAA 0.1 mg·L-1，王燕等[7]研究結(jié)果表明適宜的生根培養(yǎng)基是1/2MS+IBA 0.2 mg·L-1，本試驗中，草莓組培苗的生根培養(yǎng)可以不添加激素，其生根率也可達(dá)到100%。馴化移栽階段：瓶內(nèi)煉苗7～8 d，可向基質(zhì)中移栽，在溫濕度可調(diào)控連棟溫室中培養(yǎng)25 d，成活率98%。

本試驗優(yōu)化了草莓組培脫毒育苗技術(shù)的全部過程，為草莓組培快繁提供一定理論基礎(chǔ)，草莓組培苗是提高草莓產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益的首要條件，草莓組織培養(yǎng)結(jié)合莖尖剝離技術(shù)，獲得草莓組培苗，可實現(xiàn)草莓的產(chǎn)業(yè)化經(jīng)營[8]。

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