海洋細菌A78的鑒定及褐藻膠裂解酶特性的研究*

劉曉明 尼秀媚 劉永光 馬晉芳 林亞君

（濰坊科技學院 山東壽光 262700）

Kaiser等［1］1968年首次報道分離自梭菌（Clostridium alginolyticum）的胞外褐藻膠裂解酶，目前，科研工作者在褐藻膠裂解酶的研究領域取得大量成果，例如，藻酸雙脂鈉（PPS）、海立特等海洋藥物的問世極大地鼓舞了科學工作者向海洋要寶的信心。褐藻膠作為源自褐藻植物細胞壁的水溶性酸性多糖，在農業、食品、醫藥和化工等領域具有廣泛的應用價值［2］。

海藻肥料作為新一代天然海洋生物肥料，具有多種高活性成分和營養元素，有明顯的增產效果和極強的抗逆作用，在環境保護、經濟效益方面的表現突出［3］。目前，比較常見的褐藻膠降解糖化方法包括稀酸加熱法、堿降解法、氧化降解法、直接加熱法、輻射法和生物方法［4］。生物方法具有高效、預處理簡單和無污染等優點，是褐藻膠糖化的必 要手段［5-7］。

微生物發酵除了能產生高營養價值的海藻肥外，其產生的褐藻膠裂解酶酶解產物褐藻寡糖還能抗凝血、降血糖血脂［8-9］、抗腫瘤［10–11］、清除自由基［12］、促進腸道雙歧桿菌生長［13］，具有較高的食用和藥用價值。因此,篩選和發現高效的褐藻膠降解菌,對其褐藻膠裂解酶進行研究已逐漸成為微生物應用領域的研究熱點［5-6］。

褐藻膠裂解酶來源廣泛，例如，海藻類、海洋軟體動物、棘皮動物、海洋細菌、陸生真菌及土壤細菌等［14］，微生物來源主要有假交替單胞菌（Pseudoalteromonas）［15］等。

菌株A78 篩選自腐爛的海帶，能在48 h 內高效降解海帶塊，具有較強的褐藻膠降解功能和應用潛能。對菌株A78 的鑒定及其所產褐藻膠裂解酶的特性進行研究，為該類微生物資源降解褐藻膠及褐藻生物能源轉化提供數據支持。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與培養基

菌株：從海帶中分離純化出的海洋細菌A78。

試劑：DNS 試劑、褐藻酸鈉（化學純，國藥）、蛋白胨、瓊脂、酵母膏、磷酸高鐵（分析純，國藥）、2×PCR MasterMix（杭州寶賽）。

培養基：2216E 培養基（添加濃度為0.1 g／L磷酸高鐵）、LB 液體培養基（北京陸橋）。

緩沖液：不同pH 值的緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液pH=4～8、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液pH=9～10。

1.2 引物合成 菌株16S rDNA 序列擴增引物選用27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′ 和1541R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。引物由上海生工生物工程有限公司（上海生工）合成。

1.3 方法

1.3.1 褐藻膠酶活性透明圈驗證 在2216E 培養基中添加20 g／L 的褐藻酸鈉溶液和0.1 g／L的磷酸鐵溶液，高壓滅菌，冷卻至室溫后，將海洋細菌A78 接種至2216E 培養基中30℃培養5～7 d。加入10%的氯化鈣，靜置30 min，觀察是否有透明圈產生。

1.3.2 PCR 反應與測序 以27F 和1541R 為引物，以A78 菌株總DNA 為模板，通過PCR 擴增得到目的基因。PCR 反應體系為40 μL，其中含1 μL 引物27F、1 μL 引物1541R、2 μL DNA 模板、20 μL 2×PCR Master Mix 及16 μL ddH2O。反應條件為94℃5 min，94℃1 min，55℃1 min，72℃1.5 min，30 個循環，72℃3 min。PCR 產物膠回收后送至測序公司（上海生工）進行測序，序列在NCBI 數據庫進行比對。

1.3.3 褐藻膠裂解酶活性測定方法 本實驗采用DNS 法（比色法）測褐藻膠裂解酶的活性［12-13］。

1.3.4 褐藻膠酶最適溫度與最適pH 值的測定本實驗設置了20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃共8 個溫度梯度，pH 值為4、5、6、7、8、9和10 共7 個梯度，分別使用了磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液進行配制。

1.3.5 不同濃度誘導物對菌株產酶的影響 50 mL LB 培養基中分別加入0.5%、1%、1.5%的褐藻酸鈉和等大的海帶塊，接入相同量的菌液，30℃培養48 h，觀察海帶降解情況并檢測褐藻膠酶活性判斷誘導物對菌株A78 產酶的影響。

2 結果與討論

2.1 海洋細菌A78 種類鑒定

2.1.1 海洋細菌A78 產褐藻膠酶確認 細菌A78 在2216E 培養基中培養5 d 后，菌落呈現圓形，乳白色，菌落較大，表面光滑，邊緣透明。添加10%的氯化鈣，菌落周圍能產生明顯的透明圈，說明菌株A78 菌能產生褐藻膠裂解酶。

2.1.2 海洋細菌A78 的生理生化特征 對海洋細菌A78 進行23 項理化指標測定，結果如表1所示。由細菌A78 生理生化特性可知，海洋細菌A78 可將蔗糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖等作為唯一碳源，卻不能將麥芽糖、山梨醇、某些氨基酸等作為碳源，這與已報道的交替假單胞菌屬細菌的生理生化結果比較相似。

表1 海洋細菌A78 生理生化特性

2.1.3 海洋細菌A78 的16S rDNA 序列鑒定 利用引物27F 與1541R 擴增菌株A78 部分16S rDNA 序列，得到1 500 bp 左右的PCR 產物，測序結果在NCBI 數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.govBlast/）對比，獲取與其相似度較高的標準菌株序列，比對結果顯示A78 菌株與假交替單胞菌（Pseudoalteromonas nigrifaciens）的相似度達到99%以上，親緣關系最近，因此菌株A78 初步鑒定為假交替單胞菌。

2.2 海洋細菌A78 的褐藻膠裂解酶的誘導培養將海洋細菌A78 置于50 mL LB 肉湯培養基中，在LB 肉湯培養基中分別添加0.5%、1%、1.5%的褐藻酸鈉和海帶。從圖1可觀察到，加入1%褐藻酸鈉的LB 培養基中的2 塊海帶有一塊已經完全降解，另一塊也接近降解。在添加0.5%及1.5%褐藻酸鈉的培養基中，海帶只進行了初步降解，說明1%褐藻酸鈉誘導下該菌株產生的褐藻膠酶數量較大，太高或太低濃度的褐藻酸鈉都不利于誘導菌株A78 產酶。

圖1 加入不同濃度褐藻酸鈉誘導海帶塊降解情況

分別在上清液與菌體分離、未分離的情況下檢測褐藻膠酶活性，結果1%褐藻酸鈉誘導下，上清液加菌體褐藻膠酶活最高。單獨上清液或菌體酶活都比較低，說明該菌所產褐藻膠裂解酶在上清液中與菌體上都存在；1%褐藻酸鈉誘導下酶活最高，說明濃度適中的誘導物能明顯提高菌株A78 褐藻膠酶產量。未加誘導物與加入0.5%褐藻酸鈉、1.5%褐藻酸鈉及海帶塊的褐藻膠裂解酶酶活沒有明顯差距，說明誘導物對菌株A78 產酶有重要影響，且濃度是關鍵因素；具體數據見圖2。

圖2 A78 菌株在不同誘導物誘導作用下的褐藻膠裂解酶活性

2.3 不同溫度與pH 值對褐藻膠裂解酶活性影響

2.3.1 不同溫度對褐藻膠裂解酶活性影響 溫度是影響酶活性的重要因素。本研究設置了20℃～55℃之間8 個溫度梯度，研究了菌株A78 所產褐藻膠裂解酶酶活與溫度之間的關系。通過圖3可推斷，褐藻膠裂解酶的活性在20℃～25℃之間活性接近零，但是在溫度升高至30℃的過程中，酶活快速增長，30℃時已達到酶活的最大值82.6 U／mL；當溫度繼續升高至40℃，酶活又逐漸降低；當溫度達到45℃時，酶活有所回升，但依舊較低；當溫度升高到55℃時，酶活接近零。

圖3 不同溫度對菌株A78 褐藻膠裂解酶活性影響

2.3.2 不同pH 值對褐藻膠裂解酶活性的影響不同的pH 值對褐藻膠裂解酶的活性有著很大的影響，過酸或過堿都會破壞酶的結構，從而影響酶的活性［16］。設置pH 值為4～10 之間的7 個梯度，在30℃培養菌株A78。根據圖4可得出，當pH 值從4 變至5 時，褐藻膠裂解酶的活性明顯上升，在pH 值為5～5.5 之間活性最高，可達到70 U／mL左右。當pH 值由5 達到7 時，褐藻膠裂解酶的活性接近零。說明菌株A78 所產的褐藻膠裂解酶適合偏酸的條件下發揮酶活。

圖4 不同pH 值對菌株A78 褐藻膠裂解酶活性影響

2.3.3 培養時間對細菌A78 褐藻膠裂解酶活性的影響 在1%褐藻酸鈉誘導的LB 液體培養基中，每隔4 h 檢測一次褐藻膠酶活性，通過圖5可得出，在培養4 h 之后，發酵液中褐藻膠裂解酶的活性大約為75 U／mL；12 h 以內酶活基本不變；但是在培養12 h 之后，褐藻膠酶活性急劇下降，至32 h 達到最低點，褐藻膠裂解酶的活性接近零。32 h 后，酶活又有所升高，在培養52 h 之后，酶活再次降低。

圖5 不同細菌培養時間對褐藻膠裂解酶活性影響

出現該發酵過程可能的原因是，菌株A78 在發酵前期迅速合成褐藻膠裂解酶，酶的初步產量較高。在12 h 以后，大量分泌到上清液中的褐藻膠酶與底物充分作用，消耗巨大，因此，褐藻膠酶活力逐漸降低。在32 h 后，培養基中的褐藻酸鈉被逐漸消耗殆盡，褐藻膠裂解酶的消耗量降低，因此褐藻膠酶活力又有所上升。菌株A78 所產生的褐藻膠裂解酶是誘導酶，在發酵過程中邊產生邊消耗，因此，發酵過程中酶活波動較大。

3 結論

菌株A78 分離自日本海域的腐爛海帶，褐藻膠酶篩選平板結果表明菌株A78 具有褐藻膠酶活性。通過生理生化特征及16S rDNA 序列分析對其進行鑒定［15，17］，初步鑒定結果為假交替單胞菌。

適當濃度的誘導物能提高菌株A78 的褐藻膠酶產量，但褐藻膠酶活力與已報道的菌株相比沒有顯著優勢［16］，而在海帶塊降解實驗中，本菌株能在48 h 內將海帶塊降解，優勢明顯。在酶活檢測過程中，上清液或菌體中均能檢測到酶活，而上清液+菌體酶活最高，該結果表明，菌株A78 所產的褐藻膠裂解酶在上清液和菌體表面均有分布，上清液與菌體表面的褐藻膠裂解酶可能是1 種或多種褐藻膠裂解酶，通過協同作用達到高效降解褐藻膠的效果。

溫度實驗中，菌株A78 褐藻膠酶活力峰有2個，其中一個主峰在30℃左右，另一個酶活峰出現在45℃左右；pH 值實驗中，酶活力峰有2 個，其中一個主峰是在pH=5 左右，另一個小的酶活峰在pH=9 左右。出現這種結果可能是該菌含有1個以上褐藻膠裂解酶基因，而2 個基因表達的酶的量與特性有較大區別，但要清楚的確證，還需要進行后續的菌株A78 褐藻膠裂解酶的分離純化，并進行純化酶的特性研究。

本研究初步探究出由海洋細菌A78 產的褐藻膠裂解酶與底物反應的最適pH 值、溫度及細菌培養的最適時間，發現當溫度為30℃、pH 值為5～5.5、培養時間為4～12 h 時褐藻膠裂解酶的活性最高。同時，還發現A78 細菌在1%褐藻酸鈉的誘導下才能產出大量的褐藻膠裂解酶，過高或過低的誘導物濃度都不利于該菌產酶。研究結果對假交替單胞菌的開發應用提供研究基礎和數據支持。