不同劑量咪達唑侖通過上調miR-33a-5p抑制膠質瘤細胞的增殖、凋亡

趙利芳 楊建功

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院麻醉與圍術期醫(yī)學科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

1 材料與方法

1.1材料 膠質瘤細胞SHG139和U87購自中國科學院上海細胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibico公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒、凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)與分組 膠質瘤細胞SHG139和U87用RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，分別用終濃度為0、15、30、60 μg/ml的Mida處理，作為Mida組，正常培養(yǎng)的細胞作空白對照(NC)組，將miR-con、miR-33a-5p轉染至SHG139和U87細胞，記為miR-con組、miR-33a-5p組；將anti-miR-con和anti-miR-33a-5p分別轉染至60 μg/ml Mida處理的SHG139和U87細胞中，記為Mida+anti-miR-con組、Mida+anti-miR-33a-5p組。

1.3實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-33a-5p和同源盒蛋白(Six)1 mRNA表達水平 提取各組細胞總RNA，反轉錄成cDNA，miR-33a-5p和Six1分別以U6和β-actin為內參進行PCR擴增，相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.4Western印跡檢測Six1、增殖細胞核抗原(PCNA)和裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase)-3的表達 提取各組總蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，曝光顯影，定影，分析蛋白條帶的吸光度，計算蛋白表達水平。

1.5MTT檢測細胞活性 各組細胞培養(yǎng)48 h，按試劑盒說明書操作，酶標儀檢測570 nm處吸光度(OD)值。細胞活性(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.6克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力 將轉染后的各組SHG139、U87細胞以每孔200個細胞接種于6孔板，每隔2 d換液1次，并觀察細胞形態(tài)，克隆形成以絕大多數(shù)單個細胞數(shù)大于50為止。克隆形成后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，再用4%的多聚甲醛室溫固定30 min，吸去固定液用吉姆薩染液染色10 min，水洗風干后，顯微鏡觀察下拍照計數(shù)。

1.7流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，依據(jù)試劑盒說明書操作，加入Annexin V-FITC和PI避光孵育，最后上流式細胞儀檢測。

1.8熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-33a-5p對Six1的靶向調控 構建Six1的3′UTR熒光素酶野生型和突變型載體(WT-Six1和MUT-Six1)，將其分別與miR-con和miR-33a-5p共轉染至SHG139和U87細胞中，依據(jù)說明書要求，檢測熒光素酶活性。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.00軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1不同劑量的Mida對膠質瘤細胞增殖的影響 隨Mida濃度升高，膠質瘤細胞SHG139和U87的細胞活性降低，細胞克隆形成能力也降低，PCNA蛋白表達水平降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、表1。

1～4:Mida 0.0 μg/ml組、Mida 15.0 μg/ml組、Mida 30.0 μg/ml組、Mida 60.0 μg/ml組；圖3、圖4同圖1 Western印跡檢測PCNA表達

表1 不同劑量的Mida對膠質瘤細胞活性和克隆形成的影響

2.2不同劑量的Mida對膠質瘤細胞凋亡的影響 隨著Mida濃度升高，膠質瘤細胞SHG139和U87的凋亡率升高，Cleaved-caspase-3蛋白表達水平升高，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2，表2，圖3。

圖2 流式細胞術檢測膠質瘤細胞凋亡率

表2 不同劑量的Mida對膠質瘤細胞凋亡的影響

圖3 Western印跡檢測Cleaved caspase-3表達

2.3不同劑量的Mida對膠質瘤細胞對miR-33a-5p和Six1表達的影響 隨著Mida濃度升高，膠質瘤細胞SHG139和U87中miR-33a-5p表達水平升高，Six1 mRNA和蛋白表達水平降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 Western印跡檢測Six1蛋白表達

表3 不同劑量Mida對膠質瘤細胞對miR-33a-5p 和Six1 表達的影響

2.4miR-33a-5p靶向調控Six1 TargetScan預測到Six1與miR-33a-5p存在結合位點(圖5)。WT-Six1與miR-33a-5p組共轉染后膠質瘤細胞SHG139和U87的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。見表4。miR-33a-5p組Six1表達水平顯著低于miR-con組；anti-miR-33a-5p組Six1表達水平顯著高于anti-miR-con組(P<0.05)。見圖6、表5。

圖5 miR-33a-5p與Six1 3′UTR的靶向序列

表4 熒光素酶實驗驗證miR-33a-5p 靶向調控

1～4：miR-con組、miR-33a-5p組、anti-miR-con組、anti-miR-33a-5p組圖6 miR-33a-5p靶向調控Six1表達

表5 miR-33a-5p 調控Six1表達

2.5轉染miR-33a-5p抑制膠質瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡 與miR-con組相比，miR-33a-5p組細胞活性和克隆形成能力降低，細胞凋亡率升高，Six1、PCNA蛋白表達水平降低，Cleaved-caspase-3蛋白表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖7、表6、表7。

1～3：NC組、miR-con組、miR-33a-5p組圖7 Western印跡檢測Six1、PCNA、Cleaved caspase-3蛋白表達

表6 轉染miR-33a-5p 抑制膠質瘤SHG139細胞增殖和誘導細胞凋亡

表7 轉染miR-33a-5p 抑制膠質瘤U87細胞增殖和誘導細胞凋亡

2.6干擾miR-33a-5p部分逆轉Mida對膠質瘤細胞的抑制作用 與NC組相比，Mida組細胞活性和克隆形成能力降低，細胞凋亡率升高，Six1、PCNA表達水平降低，Cleaved-caspase-3表達水平升高(P<0.05)；與Mida+anti-miR-con組相比，Mida+anti-miR-33a-5p組細胞活性和克隆形成能力升高，細胞凋亡率降低，Six1、PCNA表達水平升高，Cleaved-caspase-3表達水平降低(P<0.05)。見表8、表9、圖8。

表8 轉染anti-miR-33a-5p部分逆轉Mida抑制膠質瘤SHG139細胞增殖和誘導細胞凋亡

表9 轉染anti-miR-33a-5p部分逆轉Mida抑制膠質瘤U87細胞增殖和誘導細胞凋亡

1～4：NC組、Mida組、Mida+anti-miR-con組、Mida+anti-miR-33a-5p組圖8 轉染anti-miR-33a-5p部分逆轉Mida抑制膠質瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡

3 討 論

膠質瘤是成人神經系統(tǒng)惡性腫瘤，其高侵襲性、高復發(fā)性與不良預后相關，究報道m(xù)RNA可影響膠質瘤的進展〔10，11〕。研究報道上調miR-33a-5p表達通過調節(jié)雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號傳導可抑制肺腺癌細胞的增殖和遷移，并增加細胞凋亡，還能增強對雷公藤紅素的敏感性〔12〕。miR-33a通過調節(jié)β-連環(huán)蛋白(β-catenin)抑制肺癌細胞的增殖和侵襲〔13〕。本實驗結果說明高表達miR-33a-5p可抑制膠質瘤的增殖，促進細胞凋亡。PCNA是DNA合成所必需的的核蛋白，可作為細胞增殖指標，有研究報道PCNA在腦膠質瘤細胞中表達增加〔14〕。Caspase-3是調控凋亡的核心蛋白酶，Cleaved caspase-3是Caspase-3活化過程中產生的，其表達可反映細胞凋亡〔15〕。本實驗說明miR-33a-5p可抑制膠質瘤的增殖，促進細胞凋亡。Six1定位于14α23染色體，是大腦發(fā)育中的關鍵調節(jié)因子，也是上皮間質轉化(EMT)中重要的轉錄因子，與腫瘤細胞的遷襲和轉移有關〔16〕。有研究報道Six1在膠質瘤中高表達，與患者預后不良相關〔17〕。本實驗提示miR-33a-5p可能通過Six1影響膠質瘤的增殖、凋亡。

腫瘤治療除了手術切除，一些麻醉藥也可有效抑制腫瘤活性。Mida是一種常用的麻醉藥，研究發(fā)現(xiàn)Mida通過介導miRNA-520d調控STAT3通路，可誘導肺癌細胞凋亡〔4〕。Mida還可通過下調USP22抑制人結腸癌SW480細胞增殖〔18〕。此外，Mida可有效調節(jié)急性顱腦損傷患者免疫平衡、改善應激狀態(tài)，保護腦組織〔19〕。本實驗結果說明Mida可抑制膠質瘤細胞增殖、促進細胞凋亡，可能通過調控miR-33a-5p及Six1影響膠質瘤細胞的增殖和凋亡。

綜上所述，Mida可抑制膠質瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，其機制可能是與miR-33a-5p、Six1表達水平相關，將為膠質瘤的治療提供新思路和新靶點。