煙草青枯病發病程度的影響因素分析

樊 俊，譚 軍，王 瑞*，施河麗，夏鵬亮，趙秀云

1.湖北省煙草公司恩施州公司技術中心，湖北省恩施市市府路65號 445000 2.華中農業大學生命科學技術學院，武漢市洪山區獅子街1號 430070

煙草青枯病是由勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種易感染、傳播快、危害大的土傳細菌性病害，是煙葉生產中的常見病害之一［1］。青枯病侵染煙株會造成植物快速枯死，給煙葉生產帶來較大的經濟損失，已成為限制煙草產業可持續發展的主要瓶頸之一［2］。

良好的土壤生態環境是農業生產可持續發展的重要基礎［3］。土壤的養分平衡是促進煙株生長發育、增強植株抗病能力的關鍵措施之一［4-5］。李集勤等［6］通過相關性分析表明，土壤pH與青枯病發病率、病情指數均呈極顯著負相關。有研究認為，土壤板結、酸堿度不平衡、理化性狀惡化、礦質營養不足等可能是煙草青枯病發生的重要原因［7-8］。另外，土傳病害的發生與土壤微生物的群落結構和特異性微生物的數量關系密切［9-10］。李小龍等［11］試驗表明，勞爾氏菌在侵染植物過程中，能夠引起植株感病部位微生物群落結構和多樣性變化。煙株土壤微生物群落結構越豐富，多樣性越高，抵抗病原菌的綜合能力越強［12-13］。煙草青枯病的發生與土壤性狀［14］、微生物結構［15］等有密切關系，通過調節植煙土壤微生態環境來抑制青枯病的發生已成為研究的熱點之一［16-17］。然而，土壤是一個整體生態系統，目前不同青枯病發病程度的土壤理化性狀、微生物群落差異的綜合研究卻鮮見報道。為此，采用分組分析、典范對應分析、相關性分析、主成分分析和最小數據集的方法，研究不同青枯病發病程度的土壤因子，旨在明確影響青枯病發病的關鍵因素，為煙草青枯病的防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

土壤取樣區位于湖北省恩施州宣恩縣椒園鎮和曉關鄉，兩個鄉鎮均是湖北省恩施州烤煙主產鄉（鎮），煙葉種植集中度較高，連作時間長。為減少其他生態因素引起的土壤性狀差異，本試驗中的取樣點均分布在同一山系，方圓5 km范圍內，海拔在900～1 100 m。選樣區域內土壤類型為大泥土，煙草品種為云煙87，在煙苗移栽50 d左右開始發病；在移栽80 d后，調查青枯病病情指數，并選擇不同青枯病病情指數的煙田進行土樣采集。

1.2 病情調查

按照行業標準YC/T 39—1996［18］的方法，以株為單位詳細調查煙株發病情況，并計算病情指數。

1.3 樣品采集與制備

每塊煙田先確定青枯病病情指數，再按照“之”形選取10～15株發病程度相同的煙株，拔出煙株根系，采用抖動法進行根際土壤樣品采集，去除雜物并充分混勻后，分為兩份分別裝入保鮮袋和透氣棉質袋。保鮮袋中的土樣放入低溫冷藏箱（-20℃）中保存，以提取土壤微生物DNA，進行16 S rRNA測序。棉質袋中的土樣在室溫下保存，自然風干后用于測定土壤化學指標。同時選擇煙株周圍10～15 cm壟體較完整的區域采集環刀樣，將其包好后放入環刀盒，進行土壤物理指標的測定。

1.4 土壤理化指標測定

用pH計（PB-10，德國賽多利斯公司）［m（土）∶m（水）=1.0∶2.5］測定土壤pH［19］；重鉻酸鉀容量法測定有機質［19］；擴散法測定堿解氮［19］；硫酸-鉬銻抗比色法測定速效磷［19］；火焰光度法測定速效鉀［19］；乙酸銨浸提-原子吸收分光光度法測定交換性鈣、鈉、鎂和陽離子交換量［19］；原子吸收法測定有效鐵、錳、銅和鋅［20］；沸水浸提-姜黃素比色法測定有效硼［20］。采用環刀烘干法測定土壤容重、含水率、總孔隙度、毛管持水量和通氣孔隙度［21］。

1.5 土壤細菌群落高通量測序

利用Fast DNA?Spin Kit（美國麥普生物醫藥公司）試劑盒提取土壤微生物總DNA，采用正向引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'），反向引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對細菌16S rRNA的V3～V4可變區進行PCR擴增；PCR擴增體系總體積為25μL，包括土壤微生物DNA模板（10 ng/μL）2.5μL、Forward引物（1μmol/L）和Reverse引物（1μmol/L）各5μL、KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5μL。反應程序為：95℃3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，25個循環；72℃延伸5 min。擴增后用2%（質量分數）的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物品質，再經純化、質檢后建立測序文庫，采用Illumina Miseq PE250平臺由北京諾禾致源科技股份有限公司測序［15］。使用UPARSE軟件，根據97%的相似度對序列進行OTU聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP Classifier對每條序列進行物種分類注釋，選用Silva數據庫，得到OTU的分類學信息［22］。

1.6 數據處理

利用Excel 2007和SPSS 22.0軟件進行數據處理和制圖，采用LSD法進行顯著性檢驗，顯著性為P＜0.05。最小數據集確定方法：選取不同青枯病發病程度有顯著（P＜0.05）差異的土壤指標進行主成分分析。選擇特征值大于1.0的主成分為研究對象［23］。對每一個主成分而言，變量載荷因子越大對該主成分貢獻越大，定義因子載荷絕對值在最大因子載荷10%范圍內的變量為高權重變量。高權重變量間進行皮爾遜相關性分析，相關系數r＜0.7時，各高權重變量都很重要均被選入最小數據集；r＞0.7時，選擇相關系數和最大的高權重變量為最小數據集指標［24］。

2 結果與分析

2.1 煙田青枯病發病程度分析

對不同編號的煙田進行青枯病發病程度調查（圖1），病情指數為0到1的有8塊，為不發病土壤（編號為1～8）；病情指數在1到15之間的有6塊，平均病情指數為4.39，為中等發病土壤（編號為9～14）；病情指數在15以上的有10塊，平均病情指數為83.09，為高發病土壤（編號為15～24）。

圖1 煙田青枯病病情指數分布Fig.1 Disease index of bacterial wilt in tobacco fields

2.2 土壤理化性狀分析

由表1可以看出，土壤pH、交換性鈣（ECa）、有效錳（AMn）、有效鋅（AZn）、有效硼（AB）、堿解氮（AN）、速效磷（AP）在不發病與高發病土壤間存在顯著差異。土壤速效鉀（AK）、交換性鎂（EMg）、交換性鈉（ENa）、有效銅（ACu）、有效鐵（AFe）、有機質（SOM）、陽離子交換量（CEC）在不發病與高發病土壤間差異不顯著。青枯病病情指數 與 土 壤pH、ECa、AMn、AZn和 通 氣 孔 隙 度（SAP）呈顯著負相關（表2），相關系數（r）分別為-0.555、-0.499、-0.463、-0.447、-0.443，與土壤含水率（SWC）和土壤毛管持水量（SCC）呈顯著正相關，r為0.427和0.495，表明土壤pH、ECa、AMn、AZn和SAP的增加與SWC和SCC的降低可能會抑制煙草青枯病的發生。

表1 青枯病不同發病程度的土壤基本理化性狀分析①②Tab.1 Physicochemical properties of soils with different disease severities of bacterial wilt

表2 病情指數與土壤基本理化性狀相關性分析①Tab.2 Correlation analysis between disease index of bacterial wilt and soil physicochemical properties

2.3 土壤細菌門水平分析

從圖2可以看出，不同青枯病發病程度的土壤細菌中所占比例較高的門有變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）等。比較不同發病程度細菌門類的差異，變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、Candidatus_Saccharibacteria、Cyanobacteria、Armatimonadetes在發病土壤中的相對豐度高于不發病土壤；酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）等在不發病土壤中的相對豐度高于高發病土壤。隨著青枯病病情指數的增加，變形菌門、綠彎菌門、Candidatus_Saccharibacteria的相對豐度分別從24.40%、9.60%、0.54%增加到27.00%、12.50%、0.63%，而厚壁菌門和Latescibacteria的相對豐度從5.00%和0.75%降低到3.30%和0.62%。說明青枯病的發生對土壤細菌的主要門類影響較小，對部分細菌門類如變形菌門、綠彎菌門和厚壁菌門有較大的影響。

圖2 不同青枯病發病程度土壤細菌群落在門水平上的組成Fig.2 Compositions of bacterial communities at phylum level in soils with different disease severities of bacterial wilt

2.4 土壤細菌屬水平分析

不同青枯病發病程度的植煙土壤中OTUs數量在前100的細菌屬超過了全部數量的90%，多數細菌種類數量并不占優勢。不發病、中等發病與高發病土壤細菌屬中存在顯著性差異，且對煙田青枯病有影響的共10個屬，其中在不發病土壤中占優勢的有8個，包括鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、土壤紅桿菌屬（Solirubrobacter）、氣微菌屬（Aeromicrobium）、土微菌屬（Pedomicrobium）、根瘤菌屬（Rhizobium）、貪噬菌屬（Variovorax）、諾卡氏菌屬（Nocardia），另外的沙單胞菌屬（Arenimonas）、勞爾氏菌屬（Ralstonia）在高發病土壤中占據優勢（表3）。與青枯病病情指數的相關性分析表明，鞘氨醇單胞菌屬、土壤紅桿菌屬、根瘤菌屬的OTUs數量與病情指數存在顯著負相關（-0.565、-0533和-0.443），推測土壤中這3個屬細菌數量的增加有利于抑制煙草青枯病的發生（表4）。

表3 不同青枯病發病程度土壤中顯著性差異的細菌屬OTUs數量Tab.3 Amount of OTUs of significantly different bacterial genera in soils with different disease severities of bacterial wilt

表4 病情指數與差異性細菌屬OTUs數量的相關性Tab.4 Correlation analysis between disease index and amount of OTUs of bacterial genera with significantly different OTU amounts

2.5 典型對應分析（CCA）

選取在不同發病程度土壤中存在顯著差異的SWC、SCC、SAP、pH、ECa、AMn、AZn、AB、AN和AP共10個指標作為環境因子，與細菌屬水平OTUs數量進行CCA分析。結果（圖3）表明，CCA1和CCA2可以解釋變量的63.2%的信息。不發病土壤主要分布在縱坐標軸的右側，高發病土壤主要分布在縱坐標軸的左側，而中等發病土壤則在兩側均有分布。由圖中箭頭分布可以看出，SWC和SCC分布在縱坐標軸左側，與高發病土壤細菌存在正相關；土壤pH、AMn、SAP、ECa、AZn、AN、AB、AP分布在縱坐標軸右側，與不發病土壤細菌存在正相關。AMn對不發病土壤細菌影響明顯，而SCC和SWC對發病土壤細菌影響顯著。上述分析表明土壤pH、AMn、SAP、ECa、AZn、AN、AB、AP等的增加，可能有利于有益微生物群落的構建，進而抑制青枯病的發生，而SCC和SWC則有相反的作用。

圖3 微生物與環境因子之間的典型對應分析（CCA）Fig.3 Canonical correspondence analysis（CCA）between microorganisms and environmental factors

2.6 主成分分析（PCA）

對青枯病病情指數有顯著差異的10項土壤理化指標和青枯勞爾氏菌（Ralstonia）OTUs數量共11項指標進行偏相關度KMO檢驗，其KMO值為0.490（P＜0.001），說明指標之間存在相關性，適合進行主成分分析。

主成分分析結果見表5和表6，特征值大于1的主成分（PC）有4個，方差累積貢獻率占原變量總方差的76.891%，基本保留了原11個變量的特征、差異和相互關系，說明這4個主成分基本反映了青枯病發病程度的主要影響因素。第1主成分貢獻率為30.629%，其中SCC和SWC主成分載荷相對較高，分別為-0.948和-0.908，說明第1主成分是上述2個指標的綜合反映；第2主成分貢獻率為19.916%，其中pH、ECa和勞爾氏菌屬OTUs數量主成分載荷相對較高，分別為0.718、0.624和0.638。第3主成分貢獻率為13.630%，其中鞘氨醇單胞菌屬OTUs數量主成分載荷相對較高，為0.673。第4主成分貢獻率為12.716%，其中根瘤菌屬OTUs數量和AMn主成分載荷相對較高，分別為0.587和0.558。由此，可將影響青枯病病情指數的變量分為{SCC、SWC}、{pH、ECa、勞爾氏菌屬OTUs數量}、{鞘氨醇單胞菌屬OTUs數量}、{根瘤菌屬OTUs數量、AMn}共4大類。

表5 主成分分析Tab.5 Principal component analysis

表6 主成分因子載荷分析Tab.6 Factor loading analysis of principal components

2.7 最小數據集建立

由表6可知，在PC1中，高因子載荷有SCC和SWC，由于SCC因子載荷最大，且SCC與SWC的相關系數為0.952，達到極顯著水平，因此PC1中SCC選入最小數據集。在PC2中，高因子載荷為pH，而ECa和勞爾氏菌屬OTUs數量的因子載荷未能達到pH因子載荷的90%，因此PC2中僅pH入選最小數據集。在PC3中，高因子載荷有鞘氨醇單胞菌屬OTUs數量1個指標，因此鞘氨醇單胞菌屬OTUs數量入選最小數據集。在PC4中高因子載荷有根瘤菌屬OTUs數量和AMn，因為兩者相關性較小（r=0.140），均入選最小數據集。因此，影響煙草青枯病病情指數的最小數據集包括SCC、pH、鞘氨醇單胞菌屬OTUs數量、根瘤菌屬OTUs數量和AMn共5個指標，與青枯病病情指數相 關 系 數 分 別 為0.495、-0.555、-0.565、-0.443和-0.463，表明SCC、pH、鞘氨醇單胞菌屬OTUs數量、根瘤菌屬OTUs數量、AMn是煙草青枯病發生的關鍵土壤因子。

3 討論

青枯病的發生不僅受到煙草品種抗性、氣候條件等因素的影響，還與土壤理化性質和生物學特性等有重要關系［25］。土壤物理結構、養分供應水平和酸堿狀況直接或間接影響植物的抗性和土壤病原物的侵染［26］。有學者認為土壤pH、質地、通氣狀況、溫度和濕度等對植煙土壤青枯菌菌量和病害發生有很大影響［27-28］。本研究中發現，SCC與青枯病發病程度呈顯著正相關，可能取樣區域為鄂西南煙區，在煙葉生長季節雨水豐富，土壤含水量高，造成壟體通氣不良，影響了根系生長發育［29］，降低了煙株對根莖部病害的抵抗能力；同時，土壤濕度大也易于青枯病的發生［30］。本研究中不發病土壤pH明顯高于發病土壤，說明提高土壤pH有利于對煙草青枯病的控制，與譚軍等［27］、鄭世燕等［31］、黎妍妍等［32］的研究結果一致，其原因可能是酸化會加速土壤中含鋁的原生礦物和次生礦物的風化而釋放大量鋁離子［33］，煙株長期和過量吸收鋁的過程中，會導致根系遭到破壞、病菌易于入侵；同時，pH降低可促進土壤青枯勞爾氏菌豐度的增加［34］，致使煙田青枯病發病程度加重。煙草青枯病的發生與土壤礦質營養元素含量間存在密切聯系，如錳、鈣、鉬等［11，35］。有研究表明，土壤中錳是煙草生長發育必需的微量元素，對維持葉綠體結構有重要作用，能夠調節植物體內的氧化還原反應，增強植物的呼吸強度［35］。本試驗中，土壤有效錳與煙草青枯病病情指數呈顯著負相關，說明錳素營養可通過增強煙株對青枯病的抵抗能力，降低煙草青枯病的發生，與前人的研究結論相似［36］。因此，在大田煙葉生產中，需要注意改善土壤通透性，提高根系發育水平，調控土壤酸堿平衡，補充中微量營養元素（尤其是錳、鈣和鋅等），才能有效防控煙草青枯病的發生。

根據植煙土壤細菌16S rRNA測序結果可以看出，不同青枯病發病程度土壤之間的細菌門類組成基本相似，變形菌門、放線菌門和酸桿菌門等是植煙土壤中的優勢菌門，這與前人的研究結果一致［12，37］。同時，青枯病發病土壤有增加變形菌門、綠彎菌門和降低厚壁菌門細菌相對豐度的趨勢，可能煙株青枯病的發生與土壤中具有生物防治功能的芽胞桿菌類（屬厚壁菌門，如枯草芽胞桿菌等）細菌相對豐度降低、病原菌類（屬變形菌門，如大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌等）細菌相對豐度增加有關。

土壤中勞爾氏菌屬OTUs數量是煙草青枯病發病的重要因子，本研究結果表明，其與病情指數的相關系數僅為0.158，沒有達到顯著水平，說明煙草青枯病的發生除了受到土壤中勞爾氏菌屬OTUs數量的影響外，可能還與煙株自身的抗性、土壤微生物群落結構以及土壤水分狀況、養分供應水平等因素有關［12，27，38］。通過主成分分析表明，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和根瘤菌屬（Rhizobium）OTUs數量對煙草青枯病病情指數有重要影響。鞘氨醇單胞菌屬在土壤中分布廣泛，相對豐度較高［39］，具有高代謝能力與多功能的生理特性，可用于芳香化合物（如苯基脲類除草劑、六氯化苯等）的生物降解，對維護土壤生態平衡具有重要作用［40］。根瘤菌屬為固氮微生物，在氮素缺乏的土壤中具有較強的競爭優勢，土壤氮素含量的變化會影響固氮微生物與其他微生物的競爭關系，從而影響其群落組成［41］。說明土壤中鞘氨醇單胞菌屬和根瘤菌屬等不直接影響青枯病菌的中性微生物數量增加，但可能改善了土壤生態環境和養分供應狀況，促進煙株的生長發育，增強了煙株對土傳病害的抗性，進而抑制了煙田青枯病的發生。具體與青枯病的關系還有待進一步的研究。

4 結論

煙草青枯病病情指數與土壤pH、ECa、AMn、AZn、SAP和鞘氨醇單胞菌屬、土壤紅桿菌屬、根瘤菌屬等菌屬微生物OTUs數量呈顯著負相關，與SWC、SCC呈顯著正相關。主成分和最小數據集分析表明，SCC、pH、AMn和鞘氨醇單胞菌屬、根瘤菌屬等的OTUs數量是影響煙草青枯病發生的關鍵土壤因子。