分散固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水基膠中的烷基酚聚氧乙烯醚

楊 飛，孟冬玲，鄧惠敏，紀 元，賈 楠，王 穎，劉珊珊，范子彥，邊照陽，唐綱嶺*

1.國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)翠竹街6號 450001 2.廣西中煙工業(yè)有限責任公司，南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)北湖南路28號 530001 3.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

烷基酚聚氧乙烯醚（Alkylphenol ethoxylates，APnEO）廣泛用作非離子表面活性劑、抗氧化劑、乳化劑、分散劑、消泡劑和農(nóng)藥助劑［1-2］。烷基酚聚氧乙烯醚及其降解產(chǎn)物具有較強的生態(tài)毒理效應以及生物累積性，通過食物鏈在動物和人體內(nèi)積聚，影響哺乳類動物的生殖能力，被稱為環(huán)境激素［3-6］。常用的APnEO有壬基酚聚氧乙烯醚（Nonylphenol ethoxylate，NPnEO）和辛基酚聚氧乙烯醚（Octylphenol ethoxylate，OPnEO），其平均乙氧基單元數(shù)（n）一般在2~16之間，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。GB/T 20708—2019《紡織染整助劑產(chǎn)品中部分有害物質(zhì)的限量及測定》規(guī)定壬基酚、辛基酚、壬基酚聚氧乙烯醚、辛基酚聚氧乙烯醚的質(zhì)量分數(shù)之和應小于1 000 mg/kg［7］。水基膠是一種重要的煙用材料，受原料、工藝等生產(chǎn)條件的影響，水基膠中可能會有烷基酚聚氧乙烯醚。為保障煙用水基膠的安全，要求定期對煙用水基膠進行質(zhì)量抽檢。目前，烷基酚聚氧乙烯醚的分析方法主要有GC法［8］、GC-MS法［9］、凝膠色譜法［10］、HPLC法［11］及LC-MS法［12-15］等，主要涉及紡織品、土壤、水、農(nóng)藥制劑等樣品。而對于煙用材料中烷基酚聚氧乙烯醚分析的報道很少，僅見張洪非等［16］采用高效液相色譜分析水基膠中的烷基酚聚氧乙烯醚，由于高效液相色譜法選擇性差，經(jīng)常導致假陽性結(jié)果出現(xiàn)。氣相色譜法可以直接測定聚合度較低的APnEO，但是高聚合度的APnEO需要衍生化后才可以測定。目前，液相色譜-質(zhì)譜法是最廣泛、最成熟的方法。

圖1 辛基酚聚氧乙烯醚和壬基酚聚氧乙烯醚的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of octylphenol ethoxylate and nonylphenol ethoxylate

選擇高效提取、凈化的技術(shù)是實現(xiàn)痕量殘留物有效提取與準確定量的前提。水基膠樣品常見的凈化方式有液液萃取［17-18］和固相萃取［19］。但這些方法存在溶劑量消耗大、耗時較長、對環(huán)境不友好等缺點。分散固相萃取是將適量的凈化劑直接作用于提取液中，盡可能多地吸附雜質(zhì)同時保留目標化合物。與固相萃取相比，分散固相萃取少了淋洗、洗脫等步驟，相對更為快速和簡便。為此，建立了以甲醇超聲提取、C18分散固相萃取凈化、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測水基膠中烷基酚聚氧乙烯醚的方法，旨在為水基膠中烷基酚聚氧乙烯醚的測定提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

所有水基膠樣品（1#~10#）全部由水基膠生產(chǎn)商主動提供，其中，1#、2#和3#為接嘴膠，4#、5#和6#為搭口膠，7#和8#為中線膠，9#和10#為包裝膠。所有樣品儲存于棕色玻璃瓶中，于4℃下保存。

OPnEO標準品、NPnEO標準品（>98%，平均聚合度n=9），N-丙基乙二胺（PSA）、C18吸附劑、石墨化炭黑吸附劑（AR，上海安譜實驗科技股份有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，韓國Duksan公司）；液氮（>99.99%，鄭州源正特種氣體有限公司）；醋酸銨（AR，北京百靈威科技有限公司）；超純水（自制，電阻率≥18.2 MΩ·cm）。

API 4000四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備電噴霧電離源（ESI）（美國應用生物系統(tǒng)公司）；1200系列高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Inspire HILIC色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 mm，北京迪科馬科技有限公司）；AEl63電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）；KQ5200 DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；5810-R高速離心機（美國Eppendorf公司）；VX200渦旋振蕩儀（美國Labnet公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；0.22μm有機相濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準工作溶液的配制

分別稱取10 mg OPnEO標準品和NPnEO標準品于同一個10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到OPnEO和NPnEO的濃度均為1.0 mg/mL的一級混合標準儲備液。移取100μL上述一級混合標準儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到OPnEO和NPnEO濃度均為10.0μg/mL的二級混合標準儲備液。分別移取上述二級混合標準儲備液2 000、1 000、500、200、100和50μL至6個10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得不同濃度的標準工作溶液。各標準工作溶液中OPnEO和NPnEO的濃度分別為2.00、1.00、0.50、0.20、0.10和0.05 μg/mL。所有溶液避光儲存在－20℃的冰箱中。

1.2.2 樣品前處理及分析條件

稱取0.3 g水基膠樣品于玻璃三角瓶中，加入5 mL超純水，渦旋振蕩，使樣品分散在水中；向三角瓶中加入20 mL甲醇，超聲提取20 min；以10 000 r/min的速率離心5 min，上清液待凈化。取1.5 mL待凈化液至2 mL的離心管中（內(nèi)含25 mg C18吸附劑）渦旋5 min，然后以10 000 r/min的速率離心5 min，將上清液過有機相濾膜，取500μL濾液，用500μL甲醇稀釋后進行LC-MS/MS分析。分析條件：

色譜柱：Inspire HILIC柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；色譜柱柱溫：30℃；進樣量：5μL；流動相流速：0.6 mL/min；流動相：A為5 mmol/L醋酸銨溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0~5.00 minVA∶VB=8∶92，5.00~17.00 minVA∶VB=8∶92~16∶84；17.00~22.00 minVA∶VB=16∶84；22.00~22.01 minVA∶VB=16∶84~8∶92；22.01~25.00 minVA∶VB=8∶92。離子源：電噴霧離子源（ESI）；霧化氣壓力：0.414 MPa；氣簾氣壓力：0.069 MPa；輔助加熱氣壓力：0.414 MPa；碰撞氣壓力：0.069 MPa；4種氣體均為氮氣；停留時間：50 ms；電離電壓：5 500 V；離子化溫度：500℃；正離子MRM模式采集。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 （續(xù)）

表1 辛基酚聚氧乙烯醚和壬基酚聚氧乙烯醚的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters for octylphenol ethoxylate and nonylphenol ethoxylate

1.2.3 加標樣品制備

空白加標樣品的制備參考本研究組之前的方法［20］，得到3個不同濃度的空白加標樣品，其中OPnEO和NPnEO的質(zhì)量分數(shù)分別為10、50、100 mg/kg。加標樣品按照上述前處理方法處理，每個加標水平重復測定5次。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin8.5版軟件計算平均值、回收率和相對標準偏差；采用美國應用生物系統(tǒng)公司的Analyst Software軟件采集數(shù)據(jù)。通過加和OPnEO或NPnEO所有離子的峰面積對OPnEO或NPnEO進行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件

分別通過蠕動泵注入10μg/mL OPnEO和NPnEO標準溶液，在ESI+和ESI-模式下進行全掃描，通過對比發(fā)現(xiàn)ESI+模式下有較高的響應值和對稱的峰形。由于液相系統(tǒng)中存在H+、NH4+和Na+，因此在正離子模式下APnEO容易形成［M+Na］+、［M+NH4］+和［M+H］+的母離子。在流動相中添加醋酸銨的情況下，OPnEO和NPnEO在正離子模式下主要以［M+NH4］+離子形式存在，且響應較強。相鄰聚合度的OPnEO和NPnEO間隔1個乙氧基，相對分子質(zhì)量相差44。OPnEO分子離子主要分布為m/z=（224+44n）（n=2~16），NPnEO分子離子主要分布為m/z=（238+44n）（n=2~16）。由圖2可以看出，不同聚合度的OPnEO和NPnEO呈正態(tài)分布，OPnEO的分子離子中最強m/z為620.7，NPnEO的分子離子中最強m/z為634.8，對應于乙氧基鏈的長度均為n=9。在多反應監(jiān)測（MRM）正離子模式下優(yōu)化各種質(zhì)譜參數(shù)的結(jié)果見表1。OPnEO和NPnEO的質(zhì)譜圖分別見圖2a和圖2b。

圖2 辛基酚聚氧乙烯醚（a）和壬基酚聚氧乙烯醚（b）的全掃描質(zhì)譜圖Fig.2 Full scan mass spectra of octylphenol ethoxylate（a）and nonylphenol ethoxylate（b）

2.1.2 流動相的選擇

本研究中采用的HILIC柱是親水色譜柱，是一種用來改善在反相色譜中保留較差的強極性物質(zhì)保留行為的色譜技術(shù)。由于HILIC柱采用強極性固定相，因此在HILIC分離模式中，溶劑洗脫能力為四氫呋喃<丙酮<乙腈<異丙醇<乙醇<甲醇<水，流動相中水是最強的洗脫溶劑。所以，在HILIC分離模式中一般采用乙腈-水體系作為流動相，其中水相的比例為5%~40%，以保證其顯著的親水作用［21］。本研究中考察了甲醇-水和乙腈-水體系對烷基酚聚氧乙烯醚的分離影響，結(jié)果如圖3和圖4所示。由于在HILIC分離模式中甲醇和水的洗脫能力較強，因此在甲醇-水體系中APnEO的保留能力很差。因此，選擇乙腈-水體系作為流動相。

圖3 甲醇-水體系下辛基酚聚氧乙烯醚（a）和壬基酚聚氧乙烯醚（b）的HPLC-MS/MS色譜圖Fig.3 HPLC-MS/MS chromatograms of octylphenol ethoxylate（a）and nonylphenol ethoxylate（b）using methanol-water as mobile phase

圖4 乙腈-水體系下辛基酚聚氧乙烯醚（a）和壬基酚聚氧乙烯醚（b）的HPLC-MS/MS色譜圖Fig.4 HPLC-MS/MS chromatograms of octylphenol ethoxylate（a）and nonylphenol ethoxylate（b）using acetonitrile-water as mobile phase

同時，流動相的pH會影響化合物的存在形式，從而影響其在色譜柱中的保留能力。分別考察了純水（圖5a）、0.1%（體積分數(shù)）甲酸水溶液（圖5b）、5 mmol/L醋酸銨溶液（圖5c）對APnEO分離的影響。有機相均采用乙腈作為流動相，以O(shè)P5EO和NP5EO為例，通過比較發(fā)現(xiàn)，在5 mmol/L醋酸銨溶液條件下化合物的響應最高。繼續(xù)增大醋酸銨的濃度，化合物的響應沒有明顯的增加；且緩沖鹽的濃度若太高，容易在噴針處沉積，從而堵塞噴針。因此，選擇5 mmol/L醋酸銨溶液和乙腈作為流動相。

圖5 不同pH條件下OP5EO和NP5EO的HPLC-MS/MS色譜圖Fig.5 HPLC-MS/MS chromatograms of OP5EO and NP5EO under different pH conditions

2.1.3 凈化材料的選擇

由于基質(zhì)干擾，提取液不經(jīng)凈化直接注入儀器會導致靈敏度降低，同時造成儀器污染，因此有必要對樣品進行凈化。以空白接嘴膠為例，在空白樣品中加入適量的OPnEO和NPnEO標準溶液，制備得到3個不同濃度（10、50、100 mg/kg）的空白加標樣品。考察了C18、PSA、石墨化炭黑3種分散固相萃取材料對凈化效果和回收率的影響。結(jié)果（表2）顯示：石墨化炭黑對OPnEO和NPnEO有不同程度的吸附，因此回收率較低；C18分散固相萃取材料的凈化效果最好，可以獲得較為滿意的回收率。因此，在后續(xù)實驗中采用C18分散固相萃取材料對萃取液進行凈化。

表2 凈化材料對烷基酚聚氧乙烯醚回收率的影響Tab.2 Effects of purification materials on recoveries of alkylphenol ethoxylates （%）

2.2 方法評價

2.2.1 線性方程、檢出限和定量限

在優(yōu)化的色譜條件下，對配制好的系列不同濃度的混合標準工作溶液進行測定，以不同聚合度的APnEO定量離子的峰面積之和對其質(zhì)量濃度繪制標準工作曲線。標準工作曲線的形式為Y=AX+B，其中A和B分別表示為斜率和截距。線性方程和相關(guān)系數(shù)見表3，結(jié)果表明，在0.05~2.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)，APnEO的質(zhì)量濃度和定量離子的峰面積之和具有良好的線性關(guān)系（R2≥0.998 7）。將加標空白水基膠萃取溶液中產(chǎn)生的信噪比（S/N）等于3和10時的濃度分別定義為檢出限（LOD）和定量限（LOQ），OPnEO和NPnEO的LOD分別為6.64和7.42μg/kg，LOQ分別為22.6和24.9μg/kg。

表3 烷基酚聚氧乙烯醚的線性方程、檢出限和定量限Tab.3 Linear equations,LODs and LOQs for alkylphenol ethoxylates

2.2.2 方法的回收率和精密度

采用空白樣品加標回收實驗測試方法的回收率和精密度，該方法的精密度由重復性實驗確定，并以RSD表示。空白樣品是經(jīng)過上述方法測定后不含有OPnEO和NPnEO的水基膠。制備3個不同質(zhì)量分數(shù)（10、50、100 mg/kg）的空白加標樣品，按照上述方法對加標樣品進行處理，每個濃度的樣品重復測定5次。結(jié)果（表4）顯示，在所有濃度水平下各種水基膠的回收率（79.8%~93.8%）均較令人滿意，相對標準偏差（RSD）為2.9%~6.6%。

表4 不同加標水平時方法的回收率和精密度Tab.4 Recoveries and precisions of the proposed method at different spiked levels （%）

2.2.3 方法對比

本研究中采用新建立的HPLC-MS/MS法和HPLC［16］法對3個不同添加濃度的接嘴膠樣品進行了對比分析，每個樣品重復測試5次，結(jié)果如表5所示。可知，兩個方法之間的相對平均偏差在1.3%~3.1%之間，說明不同方法之間一致性較好。OPnEO和NPnEO的HPLC色譜圖如圖6所示，HPLC-MS/MS總離子色譜圖如圖4所示。

表5 本方法與HPLC法檢測結(jié)果的對比Tab.5 Comparison of detection results between the developed method and HPLC method

2.2.4 實際樣品檢測

采用本方法和HPLC法［16］檢測了10個不同類型的水基膠樣品。結(jié)果（表6）顯示：采用HPLC法在1個接嘴膠（1#）和2個搭口膠（4#、6#）樣品中檢測出NPnEO，而采用本方法僅在2個搭口膠樣品（4#、6#）中檢出NPnEO，且檢測值與HPLC方法一致性較好。經(jīng)分析，1#樣品采用HPLC法檢出NPnEO是由假陽性造成的。NPnEO是由聚合度為2~16的壬基酚聚氧乙烯醚組成的混合物，在HPLC法中，不同聚合度的NPnEO的色譜保留時間差異很小，色譜峰重疊成一個寬峰，容易與共流出物重疊，造成假陽性（圖6）。HPLC-MS/MS在MRM掃描模式下對不同聚合度的APnEO進行監(jiān)測，選擇離子色譜峰峰形良好，具有很好的選擇性和特異性，可以避免假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。

圖6 辛基酚聚氧乙烯醚和壬基酚聚氧乙烯醚的HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of octylphenol ethoxylate and nonylphenol ethoxylate

表6 實際水基膠樣品的測定結(jié)果①Tab.6 Test results of actual water-based adhesive samples

3 結(jié)論

①建立了分散固相萃取凈化結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測水基膠中烷基酚聚氧乙烯醚的分析方法，該方法以C18為分散固相萃取劑，親水Inspire HILIC色譜柱為分析柱。②在最優(yōu)化的條件下，不同聚合度的壬基酚聚氧乙烯醚和辛基酚聚氧乙烯醚可在25 min內(nèi)實現(xiàn)基線分離。不同質(zhì)量分數(shù)下，所有分析物的回收率在79.8%~93.8%之間，相對標準偏差為2.9%~6.6%。③該方法前處理簡便、高效，靈敏度高，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可滿足實驗室中大批量水基膠樣品的準確、快速測定。