長江三角洲白山羊保種群體的SSR遺傳多樣性分析

李丹陽,孫玲偉,吳彩鳳,張樹山,張德福*,戴建軍*

(1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2.上海市農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海市農業(yè)遺傳育種動物遺傳工程研究室，上海 201106)

長江三角洲白山羊，又稱海門山羊，是長江三角洲地區(qū)主要山羊品種之一，是我國珍貴的少有的皮、肉、毛兼優(yōu)的山羊品種[1]。其羊毛潔白、彎曲少、具光澤，常用于制筆，有“筆料毛山羊”之稱；肉質細嫩、膻味小、脂肪分布均勻、味道鮮美；皮質致密、柔韌，為革皮原料。崇明白山羊屬于長江三角洲白山羊的一個分支，在上海崇明島特定水土條件下孕育而成。現(xiàn)如今，長江三角洲地區(qū)白山羊絕大部分為雜交群體，純種海門山羊和崇明白山羊的飼養(yǎng)僅限于個別保種場內，因此對該品種的種質資源保護和利用提出了嚴峻的挑戰(zhàn)。

物種或居群的遺傳多樣性大小是長期進化的產物，是其生存適應和發(fā)展進化的前提[2]。目前評估遺傳多樣性的分子標記遺傳方法有多種，包括微衛(wèi)星標記(simple sequence repeat，SSR)[3]、MHC區(qū)域突變[4]、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)[5]、線粒體DNA[6]等。微衛(wèi)星標記具有數量多、基因組內分布廣、多態(tài)性豐富、呈孟德爾共顯性遺傳、檢測快速方便等特點，廣泛用于分析生物遺傳多樣性和群體遺傳結構。

本研究選取30個微衛(wèi)星位點，分析長江三角洲地區(qū)兩個純種白山羊保種群體(海門山羊和崇明白山羊)和一個雜交群體的遺傳多樣性和群體結構，為長江三角洲白山羊群體的種質資源保存、雜交利用和品種選育作數據支撐，為保護其特定良好基因提供理論依據。保護白山羊遺傳多樣性還可以保證育種生產能對環(huán)境、疾病和市場需求的變化做出及時和有效的反應。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試驗樣品 供試海門山羊(Haimen goat，HM)和崇明白山羊(Chongming goat，CM)分別來源于江蘇金盛山羊繁育技術發(fā)展有限公司和上海崇明園都畜牧養(yǎng)殖有限公司，崇明本地雜交白山羊(hybrid white goat，ZY)的血液樣品來源于上海崇明島山羊養(yǎng)殖戶。因選擇群體的純種白山羊飼養(yǎng)規(guī)模較小，根據公羊采樣規(guī)模不低于10%的要求(NY/T1673—2008)[7]并結合相關研究進展[8-10]，每個群體選取樣本30只，其中公羊10只，母羊20只，抽取EDTA-K2抗凝血樣3 mL用于后續(xù)微衛(wèi)星檢測。

1.1.2主要試劑 血液基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，ROX500內標購自克勞寧(北京)生物科技有限公司，引物由通用生物系統(tǒng)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1微衛(wèi)星位點的引物設計 使用聯(lián)合國糧農組織(FAO)及國際遺傳學會(ISAG)的推薦和中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準[7]所規(guī)定的30個微衛(wèi)星位點，合成熒光標記微衛(wèi)星引物(表1)。

續(xù)表 Continued序號Number位點名稱Locus染色體位置Chromosome position引物序列Primer sequence(5′-3′)退火溫度Annealing temperature/℃等位基因大小Allele size/bp P26INRABERN185CHI18CAATCTTGCTCCCACTATGCCTCCTAAAACACTCCCACACTA55261～289P27BM6444BTA2CTCTGGGTACAACACTGAGTCCTAGAGAGTTTCCCTGTCCATCC65118～200P28P19(DYA)AACACCATCAAACAGTAAGAGCATAGTAACAGATCTTCCTACA55160～196P29TCRVB6BTA10GAGTCCTCAGCAAGCAGGTCCCAGGAATTGGATCACACCT55217～255P30DRBP1BTA23ATGGTGCAGCAGCAAGGTGAGCAGGGACTCAGTCTCTCTATCTCTTTG58195～229

1.2.2PCR 擴增 利用血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，以此為模板進行擴增。反應體系20 μL：DNA 5 μL，10×Buffer 1.5 μL，dNTPs(10 mmol·L-1)0.4 μL，引物(10 μmol·L-1)各1 μL，Taq酶0.4 μL，ddH2O 10.7 μL。PCR擴增反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最終72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。

1.2.3毛細管電泳 將產物稀釋10倍，與ROX500內標0.25 μL和超純去離子甲酰胺12.5 μL，混勻，95 ℃ 5 min，冰浴3 min，利用ABI3730測序儀進行毛細管電泳檢測。

1.2.4數據統(tǒng)計分析 利用Popgene 3.4進行數據分析，包括觀測雜合度(observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity，He)、等位基因數目(number of alleles，Na)、有效等位基因數(effective number of alleles，Ne)、Shannon指數(I)、Hard-Weinberg平衡(HWE)等指標，通過PIC-Cale軟件分析多態(tài)信息含量(polymorphism information contents，PIC)。

使用FSTAT 2.9.3.2評估F-統(tǒng)計量(Fit和Fst)、基因流(Nm)。利用R 3.2.1(https://cran.r-project.org/bin/windows/base)對群體間遺傳分化的主成分進行分析，通過Dispan軟件分析各群體間Nei’s遺傳距離和相似系數，同時利用MEGA 4.0軟件構建群體間UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 三個山羊群體等位基因頻率分析

從三個山羊群體的30個微衛(wèi)星位點的等位基因頻率(圖1)可以看出，三個群體在所檢測到的等位基因中基因頻率低的所占比例高，高頻率所占比例低，符合L形態(tài)分布。其中CM最低基因頻率為0.016 7，占17%，而最高頻率為0.983 3；HM最低頻率為0.020 0，占17%，最高頻率為0.92；ZY最低頻率為0.006 8，占9%，最高頻率為0.924 7。

圖1 三個群體的等位基因頻率分布Fig.1 Allele frequency distribution of the three populations

2.2 三個山羊群體在30個微衛(wèi)星位點遺傳多樣性分析

由表2可知，30個微衛(wèi)星位點在CM群體上的等位基因數(Na)為2(INRABERN185)～12(BM6444)個，累計等位基因數191個；HM群體的等位基因數為3(MAF209等)～13(BM6444)個，累計205個；ZY群體的等位基因數范圍為2(ETH10、MAF209)～9(BM6444)個，累計147個。部分位點出現(xiàn)期望雜合度小于觀測雜合度(Ho

表2 三個群體在30個微衛(wèi)星位點遺傳多樣性分析Table 2 Genetic diversity indices at 30 microsatellite locus in the three goat populations

2.3 三個山羊群體遺傳變異結果

由表3可知，有效等位基因數(Ne)HM>CM>ZY，分別為4.012、3.812、3.092。觀察雜合度(Ho)均值CM為0.726、HM為0.691、ZY為0.633，期望雜合度(He)CM為0.668、HM為0.683、ZY為0.617，Ho均大于He。I值均大于1(CM>ZY>HM)。CM群體的PIC均值為0.630、HM為0.647、ZY為0.567，都大于0.5，為高度多態(tài)。總體上處于H-W平衡，均高于0.05，可以保持其大小和相對應的等位基因頻率穩(wěn)定。兩個純種白山羊群體和雜交繁育群體均表現(xiàn)出較高的雜合度，高度多態(tài)性和較高的遺傳變異程度。

表3 三個群體遺傳變異結果Table 3 Genetic variation results of three populations

2.4 微衛(wèi)星位點的遺傳分化

表4統(tǒng)計結果顯示，三個山羊群體的總群體近交系數(Fit)為0.011 0，近交繁殖率低。平均基因流(Nm)為4.680 6。平均群體間基因分化系數(Fst)為0.050 7，處于0.05～0.15之間，5.07%的遺傳變異由于群體間引起的，而94.93%遺傳變異分布于群體內，遺傳分化程度中等，存在基因交流。

表4 30個微衛(wèi)星位點F-統(tǒng)計量分析Table 4 Results of F-statistics for each of 30 markers

2.5 三個山羊群體遺傳距離及聚類分析

由表5可知，三個地方山羊群體中崇明白山羊和崇明雜交山羊相似系數最大(0.909 2)、遺傳距離最近(0.095 2)；海門山羊和崇明雜交山羊相似系數較小(0.811 8)，遺傳距離較遠(0.208 5)。基于等位基因頻率對三個山羊群體進行主成分分析(圖2)，崇明白山羊與崇明雜交山羊空間坐標距離較近，具有相似的主要成分。依據遺傳相似系數對這三個群體進行聚類分析(圖3)，結果亦與表5結果一致，與主成分分析相似。

表5 三個地方山羊群體的Nei’s遺傳距離和相似系數Table 5 Nei’s genetic distance and genetic similar index among three local goat populations

圖3 三個山羊群體UPGMA聚類分析Fig.3 Dendrogram of three goad population relationship using DA-UPGMA

3 討論

利用30個微衛(wèi)星位點，崇明白山羊、海門山羊和崇明雜交白山羊群體得到等位基因數分別為191、205和147個，有效等位基因數分別為3.812、4.012和3.092個，說明群體遺傳變異較大，遺傳多樣性豐富。王蘭萍等[11]對長江三角洲白山羊的7個微衛(wèi)星位點進行分析，結果平均雜合度達到0.887，高度雜合。本研究中CM、HM和ZY三個群體的平均雜合度分別為0.668、0.683和 0.617，比上述研究結果有所降低，可能原因是群體較小且長期封閉管理導致。雜合度Ho和期望雜合度He均大于0.5，且Ho均大于He，說明群體中近交程度較輕，但在部分位點出現(xiàn)Ho0.7最優(yōu)遺傳標記；PIC>0.5高度多態(tài)位點；0.25～0.5為中度多態(tài)位點；PIC<0.25為低度多態(tài)位點)，30個微衛(wèi)星位點中只有2個位點低于0.25，海門山羊PIC均值最高,接近0.7，其余兩個群體也都大于0.5，呈現(xiàn)高度多態(tài)。呂曉陽等[14]曾用9個微衛(wèi)星位點分析海門山羊及徐淮山羊的遺傳多樣性，海門山羊平均PIC為0.311，多態(tài)信息含量不夠豐富，與本研究略有差異，可能與微衛(wèi)星位點選擇有關。三個群體的H-W平衡的平均概率差異不顯著，說明這些群體能夠保持其大小和相對等位基因頻率穩(wěn)定。然而，三個群體中的部分基因座明顯偏離了H-W平衡。可能隨著等位基因數和雜合度的降低，群體在微衛(wèi)星基因座上也失去了相對的等位基因頻率，導致基因座偏離了H-W平衡[15]。顯著的近交估計導致同質性和嚴重的Wahlund效應(Ho

有研究發(fā)現(xiàn)，雜交山羊的生長性狀得到明顯提高，但對遺傳多樣性方面研究較少[18]。從上述結果可以看出，雜交山羊30個微衛(wèi)星位點的擴增得到的總等位基因數明顯低于其他兩個群體，Na、PIC、I值及雜合度的均值與其他兩個群體相較也略低，說明雜交白山羊的多樣性是不如其他兩個群體豐富。雜交育種雖可以培育新的品種得到優(yōu)良性狀，但需要對雜交后代進行長期的觀察培育。

Wright[19]提出，F(xiàn)-統(tǒng)計量(Fit、Fst、Nm)與遺傳分化程度、近親繁殖率、Hardy-Weinberg平衡偏離指標呈正相關關系，其值在0.05～0.15間，屬中等分化水平。Nm主要分析群體間的基因交流程度，Nm越大基因交流越頻繁[20]。本研究三個山羊群體的基因分化系數(Fst)為0.050 7，和河北7個山羊群體[8]和云南山羊群體[9]分化程度相差不大。三個群體的Nm值為4.680 6。說明雖然經過長期自然選擇、人工選擇、遺傳漂變及地理隔離等因素，三個山羊群體并未產生較大的遺傳分化，同屬于長江三角洲白山羊，崇明白山羊為一個分支。遺傳距離和主成分分析也顯示，崇明白山羊和崇明雜交山羊親緣關系較近，崇明雜交群體和崇明群體聚類為一支，該結果與崇明山羊群體絕大部分為崇明白山羊經雜交繁育而來的事實情況相符。