雪茄煙葉原料發酵微生物多樣性及酶活變化研究

張磊,羅澤華,楊明川,李世貴,辛玉華,蔡斌,劉好寶,曾代龍,顧金剛*,段碧華

(1.中國煙草總公司海南省公司海口雪茄研究所,海口 570105;2.中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所,農業農村部農業微生物資源收集保藏重點實驗室,北京 100081;3.北京農學院生物與資源環境學院,北京 102206;4.四川中煙工業有限責任公司長城雪茄煙廠,四川 什邡 618400)

中國的雪茄目前已進入起步階段[1]。調制和發酵是雪茄煙葉質量形成的關鍵環節[2]，在一定溫度和濕度條件下，煙葉發酵理化特性和微生物種群會發生變化，激發煙葉內的香氣物質，改善雪茄的品質[3]和青雜氣和苦澀等氣味，促使產生獨特風味和芳香并提高燃燒性能[4]。雪茄煙葉發酵有自然發酵和人工發酵兩種方式[5]。

在微生物和環境的協同作用下，煙葉會發生一系列生化反應[6]。在發酵過程中，微生物的群落多樣性和豐度呈動態變化，產生多種水解酶，如蛋白酶、果膠酶、淀粉酶等，微生物的活動主導物質降解與轉化。微生物與酶類協同作用，將煙葉中的碳水化合物和蛋白質物質充分轉化生成一系列小分子化合物[7-12]。姚光明等[13]研究發現，中性蛋白酶對煙葉中蛋白質降解作用明顯，燃吸品質得到明顯改善；閻克玉等[14]分析發現，在煙葉發酵中添加果膠酶可降解細胞壁物質；韓富根等[15]在測定煙草多酚氧化酶酶活性時發現，pH為堿性條件下酶敏感，在偏堿情況下酶活性下降很快。關亮等[16]在不同pH緩沖液條件下試驗發現，pH為8時酶活性達到最大，pH繼續升高到9時酶活則活性下降。

本文對兩個品種的雪茄煙葉原料在不同發酵階段的微生物種群動態以及酶活特征進行研究，以期為雪茄煙葉原料發酵工藝提供理論基礎與應用參數。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試雪茄茄芯煙葉為海南不同種植地的古巴品種(樣品1)和印度尼西亞品種(樣品2)，初始水分含量25%，發酵溫度42～45℃，于發酵起始期(0 d)、發酵中期(45 d)和發酵結束期(90 d)隨機選取3把煙葉，每把煙葉中隨機抽取10片，置于自封袋中并保存于-80 ℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1樣品均質化 煙葉去筋脈后與研磨球一起裝入不銹鋼研磨罐中，液氮處理10 min，用研磨儀(60 Hz，90 s)研磨。均質儀(100 mL)中加入0.5 g煙葉粉末和40 mL PBS緩沖液(pH 7.2)充分研磨，4 ℃、3 500 r·min-1離心20 min，獲得上清液即為煙葉粗酶液。

1.2.2微生物高通量測序 采用細菌和真菌基因組提取試劑盒(D3350-02，Omega；D2300-100T，Solarbio)提取煙葉樣品中的微生物DNA并純化。以細菌和真菌DNA為模板，分別以引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)/1492R(5′-GGT-TACCTTGTTACGACTT-3′)和ITS1(5′-CGTAG-GTGAACCTGCGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTAT-TGATATGC-3′)對細菌的16S rRNA V3和V4可變區和真菌ITS1區域進行擴增。以1.0%瓊脂凝膠電泳對PCR產物進行檢測，并基于IlluminaHiseq進行測序(百邁客生物科技有限公司)。以QIME軟件以及R軟件等進行生物信息學及數據統計分析。

1.2.3酶活測定 采用福林法和3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定蛋白酶、淀粉酶和果膠酶活性[17-20]。酶活反應體系(1 mL)包括100 μL煙葉粗酶液和900 μL底物緩沖液。蛋白酶活性測定的底物緩沖液為酪蛋白溶液(pH 7.5)，40 ℃反應20 min，用多功能微孔板酶標儀(Infinite 200 PRO)測定680 nm吸光值，并基于L-酪氨酸標準品繪制的標準曲線計算酶活。淀粉酶活性測定的底物緩沖液為淀粉溶液(pH 5.6)，40 ℃反應30 min后加入1.5 mL DNS，測定520 nm吸光值，基于葡萄糖為標準品繪制的標準曲線計算酶活。果膠酶的底物緩沖液pH為4.8，48 ℃反應30 min，測定540 nm吸光值，并基于以D-半乳糖醛酸為標準品繪制的標準曲線計算酶活。

1.2.4pH測定 用pH 4.01和 6.86的標準緩沖液校準pH計(梅特勒FE 28臺式酸度計)。取一定量的煙葉粉末在40 ℃條件下干燥并過40目篩[21]，稱取2 g置于50 mL離心管中，加入20 mL蒸餾水后密封。20 ℃、200 r·min-1條件下震蕩30 min，靜置1 h后測定上清液的pH。

2 結果與分析

2.1 高通量測序結果及α-多樣性分析

通過HiSeq高通量測序從12個煙葉樣品中共獲得842 616條有效序列，代表1 879個OTU，且真菌種類較細菌更豐富(表1)。樣品1的細菌OTU數量在發酵起始為170個，發酵中期51個，發酵結束116個，呈先下降后上升的趨勢；相應的ACE指數在發酵起始為178.40，發酵中期59.46，發酵結束143.66和Chao1指數發酵初期178.5，發酵中期57.0，發酵結束133.4，呈相同變化趨勢；但香農指數由發酵初期的0.68到發酵結束2.32呈上升趨勢；辛普森指數由發酵初期0.82到發酵結束階段的0.14，呈下降趨勢。真菌OTU數量、ACE指數、Chao1指數和辛普森指數由發酵初期361個和391.18、386.6、0.82到發酵結束階段187個和189.98、192.10.21，都呈持續下降趨勢。

表1 雪茄煙葉發酵樣品的微生物多樣性分析Table 1 Microbial diversity analysis oftobacco leaves of two cultivars

樣品2的細菌和真菌OTU的數量低于樣品1，但菌群變化規律與樣品1基本一致。在發酵初期階段兩種煙葉樣品微生物種類較為豐富，隨著發酵時間的延長菌群呈特異化和專一化。

2.2 雪茄煙葉樣品的微生物群落結構

2.2.1細菌微生物群落結構 不同發酵時期雪茄煙葉樣品中的微生物群落會發生變化(圖1)。樣品1在發酵起始和中期的優勢細菌為葡萄球菌(Staphylococcus)，而發酵結束時的菌群相對豐富，優勢菌主要為腸桿菌屬(Enterobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、短桿菌屬(Brevibacterium)、葡萄球菌等。樣品2的微生物群落結構與樣品1 既有共性也有差異，樣品2在三個發酵階段的優勢細菌都是葡萄球菌，此外發酵初期和結束的優勢菌還有棒狀桿菌(Corynebacterium)、四聯球菌(Tetragenococcus)和腸道球菌(Enteractinococcus)，中期的優勢菌還有棒狀桿菌屬。

圖1 不同發酵時期雪茄煙葉細菌群落結構Fig.1 Bacterial community structure of tobacco leaves at different fermentation stage

2.2.2真菌微生物群落結構 從圖2可以看出，不同發酵時期樣品1中的真菌群落結構存在明顯區別，枝孢菌(Cladosporium)和曲霉(Aspergillus)在不同發酵階段都是優勢菌，但豐度不同。在發酵結束后雪茄煙葉的細菌和真菌群落更多元化。真菌群落結構分析表明，樣品2發酵起始的優勢菌為未知真菌，在發酵中期優勢菌變為曲霉和其他菌，結束時優勢真菌更加豐富，包括枝孢菌、曲霉、赤霉菌(Gibberella)等。

圖2 不同發酵時期雪茄煙葉真菌群落結構Fig.2 Fungal community structure of tobacco leaves at different fermentation stage

2.3 不同發酵時期雪茄煙葉樣品間基于微生物種群的聚類分析

2.3.1細菌微生物種群的聚類分析 從圖3可以看出，雪茄煙葉樣品1在發酵起始與中期兩個階段的微生物類群相似度較高，與發酵結束階段的差距較大。發酵起始與中期豐度較低且相似的細菌屬有10個，而發酵結束階段豐度高屬較多。樣品2的發酵起始和結束兩個階段的微生物類群相似度較高，與中期有一定的距離。發酵起始與結束豐度較低且相似的屬有4個，每個階段豐度較高的屬均有5個，通過熱圖分析發現雪茄樣品隨著發酵時間增加，物種更加多樣，樣品1在發酵結束這一階段物種更為多樣。

圖3 雪茄煙葉在發酵過程中的真菌多樣性聚類分析Fig.3 Cluster analysis of the fungal diversity of tobacco

2.3.2真菌微生物種群的聚類分析 真菌多樣性聚類分析結果與細菌不同。從圖4可以看出，雪茄煙葉樣品1在發酵起始與發酵中期微生物種群相似度較高聚為一類，與發酵中期差異較大。發酵前期、發酵結束具有相似豐度較低的真菌屬，在發酵中期階段度較高真菌屬有12個，種群較為豐富。樣品2在發酵前期與發酵中期微生物種群聚為一類，與發酵結束有一定的差異性。發酵前期、發酵中期有豐度較低且相似的真菌屬但較少，三個發酵階段中豐度較高的真菌屬數量均有5個。

圖4 雪茄煙葉在發酵過程中的真菌多樣性聚類分析Fig.4 Cluster analysis of the fungal diversity of tobacco

2.4 不同發酵時期雪茄煙葉樣品微生物物種分析

2.4.1細菌物種分析 從圖5可以看出，樣品1在發酵起始、中期、結束三個階段樣品共有的細菌OTU數量為27個，特有的細菌OTU數量分別為55、3、14個。發酵中期與結束兩階段的OTU數量較發酵起始有明顯的下降。不同階段樣品所含的細菌OTU數量依序為發酵起始>發酵結束>發酵中期。與樣品1 相比，樣品2 的細菌OTU較少。三個發酵階段的煙葉樣品細菌OTU 24個，但特有細菌OTU隨著發酵時間增加而不斷減少。

圖5 雪茄煙葉細菌物種Venn圖Fig.5 Venn map of bacterial species in tobacco leaf

2.4.2真菌物種分析 從圖6可以看出，樣品1在每個發酵階段的特有真菌OTU數量較多，分別為71、48、38個。三個發酵階段共有的真菌OTU為76個，不同階段樣品所含的真菌OTU數量依序為發酵起始>發酵中期>發酵結束。而樣品2的真菌OTU較為豐富，共有的真菌OTU為81個。在發酵起始階段特有的真菌OTU高達136個，是整個發酵時期真菌OTU最為豐富的一個階段。隨著發酵時間增加真菌OTU不斷減少，中期104個OTU，結束時只有46個。

圖6 雪茄煙葉真菌物種Venn圖Fig.6 Venn map of fungal species in tobacco leaf

2.5 不同發酵時期酶活變化規律研究

雪茄煙葉不同發酵時期酶活變化規律如圖7所示。可以看出，樣品1蛋白酶活性在發酵起始階段為129.89 U·g-1，在發酵中期降低，而發酵結束后活性升高至165.95 U·g-1。果膠酶活性隨著發酵時間的延長而逐漸降低，發酵結束時為0.95 U·g-1。淀粉酶活性在整個發酵過程中變化不大(0.29～0.34 U·g-1)，不同階段間差異不顯著。樣品2的酶活和變化趨勢與樣品1 有顯著差異。發酵起始的蛋白酶活性較低(26.50 U·g-1)，隨著發酵時間的延長，蛋白酶活性也在增加，發酵結束時蛋白酶活性已高達121.57 U·g-1。果膠酶活性呈現一個先上升再下降的趨勢，在發酵中期果膠酶活性高達1.60 U·g-1，而發酵起始與結束后的果膠酶活性相差較小。淀粉酶活性在發酵中期酶活最高(0.38 U·g-1)，發酵結束后淀粉酶活性比發酵起始的酶活還要低。

圖7 雪茄煙葉的蛋白酶、果膠酶和淀粉酶在發酵期間的活性變化Fig.7 Changes of protease,pectinase and amylase activities in cigar tobacco leaf

2.6 雪茄煙葉發酵過程中pH的變化

雪茄煙葉兩個樣品在發酵過程中pH的變化差異很大(圖8)。樣品1的pH在發酵中期階段pH達到7.6，呈堿性狀態，而發酵起始與結束時pH都在酸性范圍內且差異較小。樣品2的pH在發酵過程中都呈酸性狀態，且差異較小(圖8)。

圖8 雪茄煙葉的pH變化Fig.8 pH changes of the cigar tobacco leaf

3 討論

兩種雪茄煙葉樣品的微生物群落結構在發酵的三個階段有顯著差異。樣品1在整個發酵過程中細菌數量一直呈現下降趨勢，這與杜佳等[10]對雪茄茄衣人工發酵過程中葉面微生物區系研究結果一致。張曉娟等[7]在相對濕度70%、溫度40 ℃條件下對雪茄外包皮煙發酵發現細菌數量占絕對優勢，未分離到酵母和放線菌。李寧等[22]對雪茄煙葉表面微生物分離鑒定發現，人工發酵后的雪茄煙葉表面微生物數量急劇減少，細菌數量仍占絕對優勢，芽孢桿菌屬和青霉屬在發酵前后均處于優勢地位。張鴿等[23]分析了4個國家雪茄外包皮煙葉表面細菌種類，發現芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬為主要優勢菌。本研究結果表明，待測雪茄煙葉樣品中細菌以葡萄球菌屬為主，微生物多樣性豐度與種類與已有研究存在差異性，可能與樣品本身和發酵環境條件有關[24-26]。

酶活指標在雪茄煙葉發酵過程中作用明顯。樣品1蛋白酶活(165.95 U·g-1)和淀粉酶活(0.34 U·g-1)在發酵結束時期最高，果膠酶活性(1.30 U·g-1)在發酵起始時期呈最高。樣品2蛋白酶活(121.57 U·g-1)在發酵結束時期最高；果膠酶活性(1.60 U·g-1)和淀粉酶活性(0.38 U·g-1)在發酵中期活性最高。在煙葉發酵過程中不光有微生物、化學反應的協同作用，酶在整個發酵過程中起著促進作用[27]。閆克玉等[28]使用混合酶制劑來提高上部煙葉品質研究結果表明，α-淀粉酶用量10 mL·kg-1處理后的煙葉總氮含量減少、總糖含量增加，雜氣較少吸味更加醇和；蛋白酶用量80 U·g-1處理的煙葉蛋白質含量減少，總糖含量增加，余味變得柔軟干凈。黃強等[29]采用先進的固定化酶反應技術，與α-淀粉酶的催化作用來對煙葉進行保潤功效。王懷珠等[30]在烤煙中烘烤過程中外源添加淀粉類酶，酶量增加導致淀粉含量下降，水溶性糖和還原糖含量增加。

雪茄煙葉發酵過程中pH會發生變化。樣品1雪茄原料在發酵中期pH呈堿性，三個不同發酵階段pH變化較為明顯；樣品2雪茄原料在不同發酵階段pH變化較小，呈酸性狀態。本研究發現酶活的變化與pH有著密切聯系，蛋白酶的酶活在酸性條件下隨pH的升高而逐漸上升，在堿性條件下隨pH的升高迅速下降，這一研究結果與王朋朋等[19]研究結果一致。細菌中優勢菌的變化影響著果膠酶活性的變化[31-32]。