陸地棉核心種質抗黃萎病鑒定與優異種質篩選

陳斌,石榮康,王志城,劉松,李青,劉正文,孫正文,王國寧,吳金華,馬峙英,張艷,王省芬

(河北農業大學農學院，華北作物改良與調控國家重點實驗室，河北省作物種質資源重點實驗室，河北 保定 071000)

陸地棉(GossypiumhirsutumL.)作為世界范圍內栽培最廣的棉花，占全球棉花總產量的90%以上[1]。黃萎病(Verticillium wilt)是棉花生產中的重要病害，每年造成的皮棉產量損失約占總量的10%～20%[2]。棉花黃萎病是由大麗輪枝菌 (VerticilliumdahliaeKleb.)引起的土傳維管束病害。大麗輪枝菌寄主范圍廣，能夠侵染多達600余種雙子葉植物，同時常會產生新的致病類型[3]，在土壤中以微菌核的結構存活，使棉花在整個生育期都可發病[4]。棉花黃萎病防治難度大，化學防治常造成嚴重的環境污染，且目前尚無有效的藥物來防治[5]。培育抗病品種仍是防治棉花黃萎病最為經濟有效、綠色環保的措施，而鑒定挖掘棉花抗病種質資源對于抗病育種具有重要意義。

篩選抗源和選擇抗病后代都必需以抗病鑒定結果為依據。陳振聲等[6]鑒定了566個陸地棉黃萎病抗性，其中抗病及以上的品種占5.83%，耐病品種占23.50%，感病品種占70.70%；中國農業科學院植物保護研究所對1 512份陸地棉品種進行了黃萎病抗性鑒定，抗病品種只占0.80%[7]。目前，黃萎病抗性鑒定方法有田間病圃鑒定、病菌毒素鑒定及室內苗期接菌鑒定等[8-12]。田間病圃鑒定是目前應用最普遍的鑒定方法[13-15]，但田間鑒定常受到氣候條件不適宜發病、病圃土壤結構類型不一、病圃病原菌分布不均以及病圃大小無法滿足鑒定材料數量等多種因素的限制而影響鑒定結果的重復性和準確性。黃萎病菌毒素鑒定只考慮了毒素對棉花的毒害作用而沒有考慮病菌的侵染作用，而部分學者認為黃萎病的致病機制是“堵塞說”[16-17]，因而此方法有待進一步探究。苗期室內鑒定方法可操作性強，對鑒定環境的溫度和濕度可進行標準化控制，同時可對棉苗進行定點定量的接菌，準確性強、鑒定效率高，越來越受到學者們的重視而被廣泛應用。

縱觀國內外對棉花種質資源的抗病性鑒定，大多集中在對鑒定方法和評價指標的研究，或者局限在對個別單一產棉區種質資源的鑒定。雖然近年來我國育成的品種黃萎病抗性在不斷提高，但在棉花主產區黃萎病仍有大面積發生。目前，對世界范圍內的核心種質資源進行統一標準抗性鑒定的研究較少，鑒于我國陸地棉抗病種質資源匱乏且黃萎病日益蔓延的現狀，亟待對豐富的棉花種質資源進行抗病性鑒定。本研究擬對來自國內外主要產棉國(區)的419份陸地棉核心種質進行黃萎病抗性鑒定，旨在篩選出一批抗病性好的資源材料，以豐富我國棉花抗黃萎病資源，為抗黃萎病育種和抗病機制研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試419份陸地棉核心種質資源由本實驗室收集保存[18]，其中，我國三大棉區320份、美國55份、澳大利亞5份、巴基斯坦9份、巴西1份、保加利亞2份、法國1份、墨西哥1份、日本1份、蘇丹1份、前蘇聯14份、俄羅斯2份、烏茲別克斯坦1份、土耳其1份、烏干達3份、西班牙1份、乍得1份。根據我國植棉區域的不同生態條件以及棉花生產特點，結合棉產分布現狀和植棉歷史，將我國棉區劃分為北部棉區、黃河流域棉區、西北內陸棉區、長江流域棉區和南部棉區。將已知育成年代的品種劃分為三類：1970年以前育成的為早期品種，1970—1990年育成的為中期品種，1990年以后育成的為現代品種。所用黃萎病菌系為臨西2-1(LX2-1)，是本團隊于2007年從河北省植棉大縣臨西縣搜集病株，經單孢分離獲得的強致病力菌系[19]。

1.2 試驗方法

1.2.1病菌培養與病菌孢子懸浮液的制備 將4 ℃保存的LX2-1接種到PDA(potato dextrose agar)培養基上，于25 ℃培養箱中培養7 d，然后接種到PDB (potato dextrose broth)培養基中，150 r·min-1震蕩培養7 d，用雙層紗布過濾后，再用滅菌蒸餾水將懸浮液調至孢子濃度為5×107cfu·mL-1備用。

1.2.2棉苗培養與接菌 抗病性鑒定于2017年在河北農業大學植物生長室完成。種子經硫酸脫絨處理后，于清水中浸泡過夜后在濕潤的4層紗布中催芽過夜，挑選發芽整齊一致的種子播種于裝有蛭石的六棱缽中[11]。在16 h光照、8 h黑暗，光強6 000～6 500 lx，晝溫28 ℃、夜溫22 ℃，相對濕度40%～50%的氣候室內培育棉苗。

待棉苗第一片真葉完全展開時，挑選生長整齊、健壯的棉苗35株，采用本團隊建立的六棱塑料缽定量注射菌液法接種[11]。棉苗接菌后將培養室條件調整為晝溫25 ℃、夜溫22 ℃，相對濕度65%～70%，光照條件不變，繼續培養。其間定期澆灌Hoagland營養液以補充養分。所有供試材料均重復鑒定3次。

1.2.3病級調查 分別在接種后15、20、25 d，采用通用的5級分類法[19]對棉苗進行病級調查：0級，植株無病癥；1級，子葉發病，真葉無病癥；2級，子葉以上的第一片真葉發病；3級，兩片及以上真葉發病，心葉無病癥；4級，植株生長點或整株枯死。

根據病情指數(disease index,DI)將品種抗病性劃分為免疫、高抗、抗病、耐病和感病5個等級[20]，其對應的病情指數分別為：DI=0；050.0。

DI=100×∑(各病級病株數×相應病級)/(調查總株數×4)。

1.3 數據統計與分析

鑒定數據設三次重復，采用SPSS Statistics 20進行數據處理與統計分析。

2 結果與分析

2.1 供試種質資源的抗病性鑒定結果

分別在不同接種后天數(days post inoculation，dpi)調查棉苗病情指數，發現419份材料的病情指數呈正態分布(圖1)。隨著病菌侵入天數的延長，植株病癥急劇增強，在15 dpi，供試材料的平均病情指數為21.52，最高病情指數為47.86；20 dpi的平均病情指數為46.45，最高病情指數為73.33；而到了25 dpi，平均病情指數高達66.46，最高病情指數達到了90.00(表1)。感病對照冀棉11在15 dpi的病情指數為27.14，20 dpi病情指數為53.81，25 dpi病情指數為78.10。以冀棉11的病情指數超過50(達到感病)的20 dpi病情指數為標準進行不同材料的抗性分析，發現資源材料中沒有免疫和高抗的品種，篩選出中植BD13、湯棉7401、寧棉9號、中1421、魯890、中Arc73、農大棉8號、A41772BBt、遼4853、豫職師84-1、陜2812、中棉所17號共12份抗病品種(圖2)，占2.86%；耐病材料253份，占60.38%；感病材料154份，占36.75%(圖3)。總體來看，供試種質資源的抗病性差異較大，整體抗性水平較差。

圖2 12份抗病材料的病情指數Fig.2 Disease index of 12 resistant varieties

表1 供試材料病情指數變異分析Table 1 Variation analysis of disease index for the tested materials

圖1 供試材料在15、20、25 dpi的病情指數分布Fig.1 Distribution of disease index at 15,20,and 25 dpi

2.2 不同育種時期種質資源抗性比較

對有育成年代記錄的材料，根據不同時期統計病情指數，162份現代品種的平均病情指數為43.75，其中抗病品種7份，所占比例為4.32%；耐病品種113份，占69.75%；感病品種42份，所占比例為25.93%。94份中期品種的平均病情指數為48.60，其中抗病品種4份，占4.26%；耐病品種50份，占53.19%。42份早期品種的平均病情指數為51.55，其中抗病品種僅有1份，所占比例為2.38%；耐病品種16份，所占比例為38.10%；其余為感病品種(表2)。結果表明，在病情指數以及不同抗病類型所占比例上，現代品種都要好于中期及早期品種。

表2 來自不同育種時期的資源材料的抗病性表現Table 2 Performance of disease resistance of the accessions from different breeding stages

注：比例尺為4 cm。Note:Scale bars represent 4 cm.圖3 20 dpi核心種質中不同抗病類別的表型Fig.3 Different resistance types of cotton germplasm resources at 20 dpi

2.3 不同地理來源種質資源抗性比較

分析不同地理來源種質資源的病情指數發現，黃河流域棉區的164份材料平均病情指數為43.21，抗病品種10份，所占比例為6.10%；耐病品種111份，占67.68%；感病品種43份。19份北部棉區材料的平均病情指數為43.44，抗病品種有1份，耐病品種14份，所占比例為73.68%；感病品種4份。99份國外材料的平均病情指數為46.72，沒有抗病品種；耐病品種62份，所占比例為62.63%；感病品種37份。而其他植棉區品種的平均病情指數都高于50.00，并且耐病品種所占比例偏少，感病品種所占比例偏大(表3)。進一步對黃河流域棉區及北部棉區的54份現代品種病情指數進行分析，病指均值為40.82，抗病品種6份，占11.11%；耐病品種38份，占70.37%；感病品種10份。結果表明，不同地理來源的材料在抗性上存在差異，特別是我國黃河流域和北部棉區的現代品種的抗性整體要好于其他植棉區品種的抗性。

表3 不同地理來源資源材料的抗病性表現Table 3 Performance of disease resistance of the accessions from different geographic origins

3 討論

選育和種植抗病品種是防治棉花黃萎病最為經濟有效的方法[21]，近些年來，通過育種家的不斷努力已經培育出了農大601、中棉所49、魯棉研28等黃萎病抗性較好的品種，這些品種在生產中發揮著重要作用[22-24]。但隨著時間的推移，病菌不斷發生變異，因此需要育種家不斷地培育抗病棉花新品種。但目前研究者對棉花抗黃萎病機制的認識還比較薄弱，而且育種家缺乏遺傳變異豐富且抗黃萎病的優異種質資源[25]。目前，我國棉花種質中期庫共保存著來自世界50多個產棉國的8 000多份種質[26-27]，但其中絕大部分對棉花黃萎病的抗性水平尚不明確。為探明資源材料對黃萎病的抗性，為棉花抗黃萎病育種提供優異的抗病親本，同時也為抗黃萎病的機制解析提供變異豐富的遺傳材料，本研究對419份陸地棉核心種質資源進行了苗期黃萎病抗性鑒定。

1973—1980年，陳振聲等[6]采用田間黃萎病病圃種植的方法經過8年的時間分批次鑒定了566份資源材料，其中抗病品種占5.83%；1983—1986年，中國農業科學院棉花研究所采用無底紙缽定量蘸菌液法，對911份陸地棉資源進行了鑒定，抗病資源占5.16%[28]；1986—1987年，中國農業科學院植物保護研究所對1 512份陸地棉資源在枯、黃萎病混生病圃中進行鑒定，共鑒定出12份抗黃萎病材料，占供試材料的0.8%[7]。本研究鑒定的419份核心種質資源蘊藏著豐富的遺傳多樣性，病情指數分布在21.90～72.14，其中表現為抗、耐、感病的材料分別占2.86%、60.38%、36.75%，抗性材料比例相對偏少，但比枯、黃萎病混生病圃鑒定的比例偏高。黃萎病的發生受環境因素的影響較大，由于田間鑒定對外界環境因素的不可控性，特別是同一地點不同年份之間的氣候差異較大，會對鑒定結果產生較大的影響。黃萎病及枯萎病都屬于維管束病害，發病機理與抗病機制較類似，而植株本身的抗病機能是有限的，在枯、黃萎病混合病圃中同時對兩種病害進行鑒定，勢必會影響植株對其中一種病害的真實抗病反應。本研究采用室內苗期鑒定方法，在溫濕度可控的氣候室內嚴格按照適宜黃萎病發病的條件控制，溫度上下浮動不超0.3 ℃，濕度上下浮動不超過5%，因此鑒定結果會更加準確。同時核心種質的遺傳變異豐富，有很大一部分品種是早期地方農家品種，抗病性差，導致抗病品種比例不是很大。

本研究所鑒定的419份陸地棉核心種質選自全球主要棉花生產國的7 362份陸地棉種質資源庫中，雖然不同地域來源及育種時期材料數量和比例不均一，但每份種質都是根據種質庫所記錄的資源材料的表型、地理來源和SSR數據進行聚類分析，最終篩選得到的，具有地域及時期的代表性。通過對核心種質中有具體時間來源的材料進行分析，發現早期、中期、現代材料的平均病情指數分別是51.55、48.60和43.75，表明隨著近些年黃萎病菌的逐年流行，使育種家在育種過程中不再單純只注重品質和產量性狀，同時也越來越重視黃萎病抗性這一性狀，棉花抗病性已得到明顯提高。將資源材料按不同地理來源進行分析，發現來自黃河流域棉區以及北部棉區的資源材料中，抗病、耐病品種所占的比例都要高于其他幾個植棉區，來自長江流域棉區的材料抗性較差。所鑒定出的12份黃萎病抗性表現穩定的資源材料中，有10份都來自黃河流域棉區，進一步說明了黃河流域棉區的整體抗性要好于其它植棉區。20世紀70年代到90年代，我國有記載的多個省(市、區)黃萎病發病地區，主要分布于黃河流域及以北的棉區[29]。在發病較重的地區，育種家的育種目標就會傾向于抗病性狀的改良，棉花自身也會向著利于抵御病害的方向進化。