潤州鳳頭白鴨不同組織礦物元素沉積及相關基因表達研究

白皓, 李瀟凡, 仲黎, 宋倩倩, 劉本帥, 張莘,張揚, 王志秀, 江勇, 徐琪, 常國斌,, 陳國宏,*

(1.揚州大學農業科技發展研究院， 教育部農業與農產品安全國際合作聯合實驗室， 江蘇 揚州 225009;2.揚州大學動物科學與技術學院, 江蘇 揚州 225009)

礦物元素對人體生長發育至關重要，是新陳代謝過程中不可或缺的營養元素。如鎂元素幾乎參與機體所有的新陳代謝過程[1]，鉀元素可以促使神經傳導功能正常運行[2]，鐵元素與缺鐵性貧血和氧化還原等代謝紊亂密切相關[3]，鋅元素能抵抗和消滅體內的病原微生物[4]，硒元素可以增強機體免疫功能[5]。雖然這些礦物元素對維持人體正常生命活動和內環境穩態非常重要，然而人體自身不能合成，需要從各類食物中獲取。鴨肉是人們生活中重要的食品，除了含有優質的蛋白質和維生素，還富含有多種礦物元素。2019年，我國商品肉鴨出欄43.8億只，約占全球總量的68%，總產值超過1 357億元[6]。因此，大量的肉鴨產品是人體礦物元素的主要來源之一。近年來，隨著人們消費水平的提高以及對禽肉產品質量的追求，禽類的飼養量不斷增加。小體型優質肉鴨具有體型小、風味獨特、營養價值高的特點，深受消費者歡迎[7]。潤州鳳頭白鴨作為我國古老的小體型優質肉鴨遺傳資源，其肉質細膩、味道鮮美，富含人體必需的多種礦物元素。

大量研究表明，礦物元素的沉積和分解受到一些元素相關基因的影響。瞬時受體電位離子通道(transient receptor potential melastatin, TRPM)家族成員通道6(TRPM6)和通道7(TRPM7)基因是調控細胞Mg2+平衡的關鍵[8]。鈉鉀泵(Na+/K+-ATP酶)是細胞膜上一種重要的離子轉運系統，在調節血管張力和血壓方面起著重要作用，其中Na+/K+-ATP酶α1亞基(ATPase Na+/K+transporting subunit alpha 1, ATP1A1)和Na+/K+-ATP酶β1亞基(ATPase Na+/K+transporting subunit beta 1, ATP1B1)影響Na+/K+-ATP酶的活性[9]；鐵蛋白基因包括輕鏈和重鏈兩個亞基，重鏈蛋白由FTH1(鐵蛋白重鏈多肽1，ferritin heavy chain 1)基因編碼，其具有較強的亞鐵氧化酶活性，可以儲存和釋放鐵元素[10]；谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)是動物機體中含量最為豐富的硒蛋白，該家族中的谷胱甘肽過氧化物酶1(glutathione peroxidase 1, GPX1)是首個被鑒定的硒蛋白，是體內重要的抗氧化防御系統，谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 1, GPX4)主要對磷脂過氧化氫物進行催化還原，對生物膜具有抗氧化保護作用[11]；氧化磷酸化過程的關鍵酶是位于線粒體內膜上的ATP合成酶[12]，Zn+對ATP合成酶的增強效應與Zn+的濃度相關，因此Zn+被認為是ATP受體的調制物[13]，ATP6(ATP合成酶亞單位6，ATP synthase F0 subunit 6)和ATP8(亞單位8，ATP synthase F0 subunit 8)都是重要的線粒體基因。

肉鴨不僅是各種礦物元素的載體和供體，礦物元素的沉積與代謝也與肉鴨的生長性能、肉品質和抗病力密切相關。因此，研究礦物元素沉積對促進肉鴨生產和提高鴨肉品質具有重要意義。本研究以潤州鳳頭白鴨為研究對象，探究了不同組織中主要礦物元素隨日齡增加的沉積規律以及相關基因的表達水平，旨在明確小體型優質肉鴨選育指標及最佳出欄日齡，篩選礦物元素含量檢測關鍵標志基因，為建立小體型優質肉鴨高效育種技術體系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗選用150只0日齡的潤州鳳頭白鴨(小體型白羽肉鴨，公母各半)為研究對象，設置5個試驗重復，每個重復30只，公母混養。采用上網下床模式飼養至63日齡。所有試驗鴨飼養管理和環境控制條件相同，試驗期間自由采食和飲水。不同飼養階段供給的日糧配方及飼料營養水平見表1，其中，每公斤復合預混料成分為：膨潤土44.46 g、賴氨酸3.24 g、DL-MHA-FA(88%)0.99 g、蘇氨酸0.73 g、氯化鈉4.40 g、碳酸氫鈉2.00 g、硫酸鈉2.00 g、維康寶0.20 g、氯化膽堿(60%)1.00 g、金多微0.53 g、金羽康0.15 g、C-811酶0.30 g。在試驗開始前，對鴨舍進行通風和嚴格的消毒，定期按照常規的免疫程序對試驗鴨進行免疫接種，至63日齡結束。

表1 日糧配方及飼料營養水平Table 1 Composition and nutrient of the experimental diets

1.2 樣品采集

在0、21、35、49和63日齡時，每個重復隨機挑選公母鴨各1只(共10只)，采集胸肌、腿肌、肝臟、背皮(背部脊骨正中間)和脛骨5種組織樣品，每種組織采集5 g樣品于-20 ℃保存，用于礦物元素含量測定。采集肝臟組織樣品0.5 g，放入裝有RNA保護液的離心管中，于-80 ℃保存，用于RNA提取。

1.3 礦物元素測定指標與方法

1.3.1組織前處理 將試驗鴨的胸肌、腿肌、肝臟和背皮樣品分別加入濃硝酸和過氧化氫中，在消解儀[Multiwave 3000,安東帕(中國)有限公司]中高壓消解，放入加熱爐中除去硝酸，加入超純水定容，完全溶解后進行檢測。統一采集試驗鴨的右側脛骨，用去離子水沖洗后再用濾紙吸干，放入70～80 ℃恒溫鼓風干燥箱中烘干，隨后用研缽研碎，放入干燥器中保存備用。礦物元素檢測前處理的實驗步驟參照國標GB/T9695(鐵、鎂、鋅)[14-16]和已有研究(鉀、硒)[17-18]，使用微波消解儀進行消解。

1.3.2礦物元素含量測定 利用AFS-2202a原子熒光光度計(北京吉天儀器公司)測定樣品中鎂、鉀、鐵、鋅和硒的含量。儀器設定條件如下：霧化器流量0.80 L·min-1，輔助氣流量0.20 L·min-1，等離子氣流量15 L·min-1，射頻發生器功率1.3 kW，樣品提升量1.5 mL·min-1。

1.4 引物設計

根據NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)綠頭野鴨TRPM6、TRPM7、ATP1A1、ATP1B1、FTH1、GPX1、GPX4、ATP6和ATP8基因的mRNA序列設計引物(表2)[19]，由南京擎科生物科技有限公司合成。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Primer sequences used for quantitative real-time PCR

1.5 總RNA提取

采用天根公司的TRizol試劑盒提取肝臟組織總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，使用NanoDrop 2000核酸濃度測定儀檢測總RNA的濃度和純度(OD260/OD280=1.8～2.1)，最后用TE將樣品稀釋至相同濃度。

1.6 cDNA合成

利用天根公司的反轉錄試劑盒合成cDNA。反應體系20 μL：總RNA 2 μL (500 ng·μL-1)，5×FastKing-RT SuperMix 4 μL，RNase-Free ddH2O 14 μL補至20 μL。混勻后于42 ℃反應15 min，95 ℃反應3 min，反轉錄產物于-20 ℃保存備用。

1.7 qRT-PCR

根據ABI實時熒光定量PCR的步驟和要求配置反應體系：cDNA模板2 μL，PoweUpTMSYBRTMGreen master Mix(2×)5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，ddH2O 2.2 μL補至10 μL。熒光定量程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環；熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s和60 ℃ 15 s。擴增結束后進行熔解曲線分析，每個樣品設置3個重復，取平均值。

1.8 統計分析

使用Excel 2016軟件對表型和qRT-PCR結果進行數據整理，基因相對表達量采用2-ΔΔCT方法計算[20]。采用SAS 9.4軟件分別對礦物元素含量和基因表達量數據進行單因素方差分析，并采用Duncan法進行多重比較分析；采用Bivariate Correlation分析各礦物元素之間以及目的基因相對表達量與礦物元素含量之間的相關性，結果以(平均值±標準差)表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同組織中礦物元素沉積規律分析

不同日齡潤州鳳頭白鴨組織中礦物元素的沉積規律如圖1所示。

2.1.1胸肌中礦物元素沉積規律分析 在胸肌組織中，鎂和鉀元素的沉積規律一致，表現為隨日齡增加呈顯著(P<0.05)升高的趨勢，兩種元素在49—63日齡時的含量達到峰值并趨于穩定；鋅元素的沉積規律表現為隨日齡增加呈顯著性(P<0.05)下降的趨勢；鐵和硒元素的沉積規律均表現為先下降再升高再下降的趨勢，兩種元素在21日齡時的含量均顯著低于其他日齡(P<0.05)，鐵元素含量在49日齡時達到峰值(P<0.05)，而硒元素含量在0日齡時最高(P<0.05)。

2.1.2腿肌中礦物元素沉積規律分析 在腿肌組織中，鎂和鉀元素的沉積規律與在胸肌組織中的沉積規律基本一致，隨日齡增加顯著(P<0.05)升高，并在49—63日齡時穩定沉積的趨勢；鋅元素的沉積規律與在胸肌組織中的沉積規律完全相反，隨日齡增加逐漸升高，在49—63日齡時的含量趨于穩定，顯著高于其他日齡(P<0.05)；鐵元素的沉積規律表現為0—21日齡呈顯著(P<0.05)下降再逐漸升高的趨勢；硒元素的沉積規律與在胸肌組織中的沉積規律基本一致，在35日齡時的含量最高(P<0.05)。

2.1.3肝臟中礦物元素沉積規律分析 在肝臟組織中，5種礦物元素的沉積規律均表現為隨日齡增加呈顯著(P<0.05)升高的趨勢。其中，鐵元素在潤州鳳頭白鴨21—49日齡生長階段的肝臟中快速沉積，達到峰值。

2.1.4背皮中礦物元素沉積規律分析 在背皮組織中，5種礦物元素的沉積規律與上述3個組織有所不同。鎂和鉀元素的沉積規律仍然基本一致，表現為隨日齡增加先升高再下降的趨勢，兩種元素在21日齡時的含量達到峰值；鋅元素的沉積規律表現為先緩慢升高再呈顯著(P<0.05)下降的趨勢，在49日齡時的含量最低(P<0.05)；鐵元素的沉積規律表現為0—21日齡顯著(P<0.05)升高、21—35日齡顯著(P<0.05)下降、35—49日齡再顯著(P<0.05)升高、49—63日齡再顯著(P<0.05)下降的趨勢，在49日齡時的含量達到峰值(P<0.05)；硒元素的沉積規律與在胸肌和腿肌組織中的沉積規律基本一致，在35日齡時的含量最高(P<0.05)。

2.1.5脛骨中礦物元素沉積規律分析 在脛骨組織中，鎂和鉀元素的沉積規律與在背皮組織中的沉積規律基本一致，表現為隨日齡增加先升高再下降的趨勢，兩種元素在21日齡時的含量達到峰值(P<0.05)；鋅元素的沉積規律表現為在所有日齡穩定沉積，無顯著性差異(P>0.05)；鐵元素的沉積規律表現為隨日齡增加呈先升高再下降的趨勢，在21—35日齡時的含量最高(P<0.05)；硒元素的沉積規律表現為0—49日齡顯著(P<0.05)下降、49—63日齡穩定沉積的趨勢。

2.2 不同組織中礦物元素之間相關性分析

不同組織中不同礦物元素相關性分析如表3所示。

2.2.1胸肌中不同礦物元素之間相關性分析

胸肌組織中，鎂元素與鉀元素在潤州鳳頭白鴨的5個生長階段均高度正相關，其中0—21日齡呈極顯著正相關(P<0.01)，49—63日齡呈顯著正相關(P<0.05)。在0日齡時，鎂元素與鋅元素呈顯著正相關(P<0.05)；在63日齡時，鎂元素與硒元素呈顯著正相關(P<0.05)。

2.2.2腿肌中不同礦物元素之間相關性分析

腿肌組織中，鎂元素與鉀元素在5個生長階段均呈高度正相關，其中21日齡呈極顯著正相關(P<0.01)，35—63日齡呈顯著正相關(P<0.05)。在21日齡時，鎂和鉀元素分別與硒元素呈顯著正相關(P<0.05)；在35日齡時，鉀元素與鋅元素呈顯著正相關(P<0.05)；在49日齡時，鎂元素與硒元素呈顯著負相關(P<0.05)。

2.2.3肝臟中不同礦物元素之間相關性分析

肝臟組織中，鎂元素與鉀元素在5個生長階段均呈高度正相關，其中63日齡呈極顯著正相關(P<0.01)，21—49日齡呈顯著正相關(P<0.05)。在0日齡時，硒元素與鋅元素呈顯著正相關(P<0.05)；在21日齡時，鎂元素與硒元素呈顯著正相關(P<0.05)，鉀元素與鐵元素呈極顯著負相關(P<0.01)；在49日齡時，鉀元素與鋅元素呈顯著正相關(P<0.05)；在63日齡時，鉀元素與鐵元素呈顯著正相關(P<0.05)。

2.2.4背皮中不同礦物元素之間相關性分析

背皮組織中，鎂元素與鉀元素在5個生長階段均呈高度正相關，其中21、35和63日齡呈極顯著正相關(P<0.01)，0和49日齡呈顯著正相關(P<0.05)。在0日齡時，硒元素與鋅元素呈顯著負相關(P<0.05)；在21日齡時，鎂和鋅元素分別與硒元素呈顯著正相關(P<0.05)；在49日齡時，鎂元素與硒元素和鋅元素均呈顯著正相關(P<0.05)；在63日齡時，鉀元素與硒元素呈極顯著正相關(P<0.01)，鋅元素與鎂元素、鉀元素和鐵元素均呈顯著正相關(P<0.05)。

2.2.5脛骨中不同礦物元素之間相關性分析

脛骨組織中，鎂元素與鉀元素在5個生長階段均呈高度正相關，其中0、21、35和63日齡呈顯著正相關(P<0.05)。在35日齡時，鎂元素與鋅元素呈極顯著正相關(P<0.01)；在63日齡時，鐵元素與硒元素呈極顯著負相關(P<0.01)。

2.3 基因表達水平及其與礦物元素之間相關性分析

2.3.1基因表達規律分析 肝臟組織中礦物元素相關基因的表達規律見圖2。所有基因均以0日齡的表達水平作為對照組，比較不同日齡之間的基因表達差異。

鎂元素相關基因TRPM6在21日齡時的表達水平最高(P<0.05)；TRPM7基因的表達規律表現為隨日齡增加呈顯著(P<0.05)升高再顯著(P<0.05)下降的趨勢，0日齡時的表達水平最低(P<0.05)，49日齡時達到峰值(P<0.05)。兩個基因在21—35日齡時的表達規律相反，其他日齡基本一致。

鉀元素相關基因ATP1A1在21日齡時的表達水平最低(P<0.05)，49日齡時的表達水平最高(P<0.05)；ATP1B1基因的表達規律表現為先升高再下降再升高再下降的趨勢，0日齡時的表達水平最低(P<0.05)，49日齡時的表達水平最高(P<0.05)。兩個基因在0—35日齡時的表達規律相反，35—63日齡基本一致。

鐵元素相關基因FTH1的表達規律表現為隨日齡增加呈顯著性(P<0.05)升高的趨勢，49—63日齡時的表達水平最高，顯著高于0—35日齡(P<0.05)。

鋅元素相關基因ATP6在0日齡時的表達水平最低(P<0.05)，49日齡時的表達水平最高(P<0.05)；ATP8基因的表達規律表現為先顯著(P<0.05)升高再顯著(P<0.05)下降的趨勢，0日齡時的表達水平最低(P<0.05)，35日齡時的表達水平最高(P<0.05)。兩個基因在21—49日齡時的表達規律相反，其他日齡基本一致。

硒元素相關基因GPX1的表達規律表現為0—35日齡顯著性(P<0.05)下降，35—63日齡顯著(P<0.05)升高的趨勢，63日齡時的表達水平最高(P<0.05)；GPX4基因的表達規律表現為0—35日齡先升高再下降，35—63日齡顯著(P<0.05)升高的趨勢，63日齡時的表達水平最高(P<0.05)。

兩個基因在0—35日齡時的表達規律相反，35—63日齡基本一致。

2.3.2基因表達與礦物元素之間相關性分析

由表4可知，僅有鎂元素相關基因TRPM7的表達水平與鎂元素在肝臟組織中的沉積呈顯著性正相關(P<0.05)，其他基因表達水平與礦物元素沉積存在一定的正負相關性，但不顯著(P>0.05)。

表4 基因表達量與礦物元素的相關性分析Table 4 Correlation analysis between expression levels of genes and depositions of mineral elements in liver

3 討論

3.1 礦物元素沉積規律與相關性

礦物元素作為機體酶、激素和維生素等生物活性物質的重要組成成分，參與一系列物質代謝和能量代謝過程，對動物機體的生長發育和肉品質改善具有重要作用[21]。鎂是動物機體生長發育不可或缺的元素之一，鎂元素沉積可以改善禽肉品質[22-23]。武書庚等[24]研究發現，動物機體的鎂元素含量隨日齡增加迅速升高，在骨骼中大量沉積，只有25%左右的鎂元素沉積在肌肉中，與本研究結果基本一致。鉀是排在動物體內第三位的常量元素，是機體細胞內代謝的主要陽離子，對機體維持體液的酸堿平衡和滲透壓以及保持神經、肌肉反應和細胞穩態具有重要作用[25]。鐵參與整個動物機體的能量和蛋白質代謝[26]。研究表明，動物體內脾臟和肝臟組織中的鐵元素含量最高，骨骼肌中鐵元素的含量僅為肝臟組織的5%～10%[27]。本研究中胸肌和腿肌組織中的鐵元素含量約為肝臟組織中的3%～27%，與上述研究結果基本一致。鋅與白蛋白結合經血液循環首先運送到肝臟中，隨后轉運到機體的各個組織和器官中，絕大部分轉運到骨骼中[28]。肝臟是鋅的主要代謝器官，周轉速度較快，而骨骼中的鋅代謝速度較慢，含量較高[29]。本研究中鋅元素沉積量的大小排序為：脛骨>肝臟>腿肌>胸肌>背皮，與上述研究結果相同。硒是動物機體必需的微量元素[30]，對動物機體的免疫應答和氧化反應等具有重要作用[31]。Burk等[32]研究表明，硒主要分布在肝和腎中，與本研究結果基本一致。

本研究發現，鎂與鉀元素的沉積規律在所有組織中基本一致，且在潤州鳳頭白鴨的5個生長階段均呈高度正相關，表明鎂元素和鉀元素協同促進機體正常代謝，提高動物的肉品質，可作為聯合指標用于潤州鳳頭白鴨優質品系的精準選育，提高選育效率。綜合5種礦物元素在不同組織中的沉積規律發現，在胸肌、腿肌和肝臟組織中，幾乎所有礦物元素的含量在49—63日齡時達到峰值并趨于穩定，為潤州鳳頭白鴨最佳出欄日齡的選擇提供基礎數據支撐。

3.2 基因表達水平與礦物元素相關性

TRPM家族有8個基因，其中TRPM6和TRPM7兩個基因對Mg2+的通透性較高，對維持細胞內Mg2+穩態具有重要作用。Voets等[33]研究表明，TRPM6基因可以使Mg2+的親和力比對Ca2+的親和力高5倍以上，上皮細胞可以吸收全部或部分的Mg2+。滕飛翔等[34]研究表明，TRPM7可能在成年大鼠腎臟細胞內外Mg2+轉運過程中發揮重要作用。Na+/K+-ATP酶是細胞跨膜離子梯度的主要中介，其作用是維持機體的鈉離子和鉀離子平衡[35]。Mallakh等[36]研究表明，當紅細胞Na+/K+-ATP酶活性降低時，ATP1A1可以將K+泵入細胞，將Na+泵出細胞，提高細胞中K+的濃度。Blostein等[37]研究表明，ATP1B1決定了K+通道的通透性。鐵是血紅蛋白的重要組成成分，主要以鐵蛋白和含鐵血黃素形式存在于肝臟組織中，鐵蛋白是動物體內極其重要的一種儲鐵蛋白。He等[38]研究發現，鐵蛋白基因FTH1表達可以產生聚鐵效應，有利于鐵元素在動物體內的沉積。細胞膜上的ATP酶對維持細胞穩態具有重要作用。韓軍花等[39]研究表明，鋅對細胞膜上的Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活性均有影響，當鋅濃度過高或過低時，ATP酶活性均有不同程度的降低。硒主要以硒蛋白和含硒蛋白的形式存在于動物體內。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是動物體內第一個被發現的也是最為豐富的硒蛋白。GSH-Px家族包含了GPX1、GPX2、GPX3、GPX4和GPX6在內的5種亞型，其中GPX1參與了體內抗氧化防御機制，而GPX4參與了機體生物膜抗氧化防御系統[40]。

結合5種礦物元素在肝臟組織中沉積規律折線圖發現，相關基因的表達水平隨日齡呈動態變化，與礦物元素沉積具有一定的相關性。其中，TRPM7的基因表達水平與鎂元素沉積呈顯著正相關(P<0.05)，可作為鎂元素含量檢測關鍵標志基因。

本研究以潤州鳳頭白鴨為研究對象，探究了不同組織中的主要礦物元素隨日齡增加的沉積規律以及相關基因的表達水平。鎂元素和鉀元素可作為聯合指標用于潤州鳳頭白鴨優質品系的精準選育；49—63日齡可作為優質潤州鳳頭白鴨最佳出欄日齡的參考日齡；TRPM7基因可作為鎂元素含量檢測關鍵標志基因。本研究結果為小體型優質肉鴨選育指標和選育效率提供了一定的理論依據。