伊木薩克提取物及其組合物對復合應激性ED大鼠陰莖組織中ET-1與eNOS、nNOS表達的調控作用研究*

侯鵬程 阿卜杜熱伊木江·如則 毛吾蘭·買買提依明 劉文娟 斯依提·阿木提 阿地力江·伊明**

1.新疆醫科大學基礎醫學院人體解剖學教研室（新疆 烏魯木齊 830011）2．新疆醫科大學基礎醫學院生物學教研室

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是指陰莖持續（至少6個月）不能達到或維持充分的勃起以獲得滿意的性生活，以陰莖不舉或舉而不堅為主要特征，并常伴有性欲減低和早泄等癥狀，屬于男科最常見的疾病之一[1,2]。前期工作中，我們以環境雌激素污染與西北地區寒冷這一氣候特點為切入點，采用雌激素樣飼料聯合冷應激復合干預方法建立了復合應激性ED大鼠模型[3]，并結合伊木薩克片的干預進行了系列研究，初步揭示了復合應激性ED的發病機制與伊木薩克片的有效性[4,5]。現為推動該藥的二次研發，我們對該藥處方原藥材采用不同方法進行了提取，并獲得醇提物（alcohol extract,AE）、水提物（water extract,WE）和提取物組合物（combination of extracts，COE）[6]，隨后我們在復制復合應激性ED模型并研究其NO-cGMP通路與神經內分泌改變的基礎上，對伊木薩克提取物及其組合物進行了藥效評價和活性跟蹤，并進一步探討其對ED相關指標的調控作用。本文現對復合應激性ED大鼠陰莖組織中ET-1、eNOS和nNOS蛋白表達改變與伊木薩克提取物及其組合物的調控作用的研究結果報道如下。

資料與方法

一、資料

（一）實驗動物

雄性清潔級SD大鼠160只和雌性大鼠20只，體質量（230±20）g，購自新疆醫科大學實驗動物中心。

（二）主要實驗儀器

人工氣候室（西安富康空氣凈化設備工程有限公司，新疆醫科大學實驗動物中心提供）,2135型切片機（德國萊卡）。

（三）主要試劑和藥物

1.主要試劑：鼠單克隆NOS1、NOS3抗體（sc5302，sc376542，Santa Cruz，美國），小鼠單克隆抗體anti-ET-1（ab2786，abcam，美國），兔單克隆抗體anti-GAPDH（ab181602，abcam， 美 國）， 山 羊 抗 小 鼠/兔IgG（ZB-2305/ZB2301，北京中杉金橋公司），通用型SP試劑盒（SP-9000，中杉金橋），酒精、氯化鈉等常規試劑及耗材均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

2.藥物：伊木薩克水提物、醇提物和提取物組合物由研究團隊提供（專利號：CN202010285248.2）；伊木薩克片（20170702，和田維吾爾藥業股份有限公司）。

二、方法

（一）實驗動物準備

從經過交配實驗證實具有正常性功能的160只性成熟雄性SD大鼠中隨機抽取15只作為正常對照（N）組，其余145只SD大鼠作為造模（M）組，實驗前適應性飼養1周，大鼠自由飲食，飼養環境溫度為（22±2）°C，濕度為（55±5）%。

（二）環境雌激素樣飼料的制備

按每1 kg大鼠常規飼料中加入芫荽籽和菠菜籽各150 g，飼料由新疆醫科大學實驗動物中心提供。

（三）復合應激大鼠模型的建立與ED模型的篩選

正常對照組以常規方法飼養，每日提供500g普通飼料、1000ml水、200g墊料。造模組以10:00-22:00/22:00-10:00為時間標準分2個時間段交替放入溫度為（8±2）℃、濕度為（85±5）%的人工氣候室中，每日給予500 g雌激素樣飼料，水與墊料同上。造模組與正常組均隨機飲食水，以12小時為周期模擬晝夜給予人工照明。在動態檢測大鼠性功能改變的基礎上，于造模35w后，通過交配實驗篩選出ED模型，共106只，成模率為73.1%。

（四）分組與藥物干預

將篩選出的ED大鼠模型隨機分為ED組（12只）、AE組（12只）、WE組（12只）、COE組（12只）及Yimusake組（12只），并設立N組（15只）。其中Yimusake組則以伊木薩克片按照250mg/kg劑量進行干預，AE組、WE組及COE組按照伊木薩克片給藥劑量×相應提取物出膏率確定給藥劑量，即醇提物（67.88mg/kg）、水提物（18.7mg/kg）、提取物組合物（86.58mg/kg）進行干預，ED組和N組予以等劑量蒸餾水灌胃，干預周期3周，給藥頻率為1次/日。

（五）標本采集

干預結束后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液（40mg／kg體質量）進行麻醉，迅速取下陰莖組織，后半部分于福爾馬林溶液中保存；前半部分置于2ml凍存管，速凍于液氮后轉移至-80℃冰箱中保存。

（六）免疫組織化學檢測

標本以4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、切片、脫蠟至水。pH 9.0 EDTA-Tris緩沖溶液進行抗原修復；3%H2O2去離子水孵育阻斷內源性過氧化物酶。去除封閉液并滴加ET-1、nNOS和eNOS一抗液，4℃過夜。PBS清洗，滴加通用型二抗（山羊抗鼠IgG-HRP），室溫孵育30 min。PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶（三抗），室溫孵育30 min。PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素染色，氨水返藍，鹽酸乙醇分化，脫水，透明，封片。結果采用量化評分方法，細胞中的染色密度分別賦予分值:0(陰性)，1(弱陽性)，2(中陽性)，3(強陽性)，染色范圍分別賦予分值:0(＜5%)，1(5%～25%)，2(26%～50%)，3(51%～75%)，4(＞75%)。每個樣本的免疫組化量化結果=1×(%弱陽性)+2×(%中陽性)+3×(%強陽性)，因此量化結果在0(無免疫反應)到300(最大免疫反應)之間。

（七）蛋白免疫印跡法檢測

取凍存陰莖組織約100mg，剪碎，加RIPA裂解液，冰上裂解，4℃，12000rpm離心15min，BCA法檢測蛋白濃度，變性。取200μg于12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中250mA恒流電泳至分離膠底端;恒定電壓、4℃轉至PVDF膜上，封閉1 h。一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜后山羊抗小鼠熒光二抗室溫孵育2h；內參GAPDH一抗4℃孵育過夜，山羊抗兔熒光二抗室溫孵育2h，再次洗膜后分別于Quantity One系統進行灰度掃描，采用ImageJ軟件分析，以目的蛋白／GAPDH條帶吸光度值作為蛋白表達強度。

三、統計學分析

采用SPSS22.0統計軟件進行分析，計量資料用以x±S表示，多組數據做正態檢驗和方差齊性檢驗，滿足條件，采用單因素方差分析（ANOVA），如不滿足條件，求出秩次進行方差分析，檢驗水準α＝0.05。P＜0.05有統計學意義。

結 果

一、免疫組化檢測結果

（一）ET-1在各組大鼠陰莖組織中的表達結果

ET-1主要表達在大鼠陰莖海綿體竇及血管內皮細胞的細胞胞核和胞漿中,陽性表達呈棕黃色胞核及淡黃色胞漿。圖1可見，ET-1在各組大鼠陰莖組織中均有表達，其中在ED組表達量較N組顯著升高（P＜0.05）。干預后，WE、COE和Yimusake組的表達量較ED組顯著降低（P＜0.05），同時WE和COE組與N組之間無顯著差異（P＞0.05），且低于AE和Yimusake組（P＜0.05），見圖1，表1。

圖1 各組大鼠陰莖組織ET-1免疫組化結果（×400）

表1 各組大鼠陰莖組織中ET-1、nNOS、eNOS的表達量（x±S）

（二）eNOS在各組大鼠陰莖組織中的表達結果

eNOS主要表達在陰莖海綿體血管、海綿竇內皮細胞的細胞漿中，細胞核中亦有表達，陽性表達呈棕黃色。圖2結果顯示，eNOS在各組大鼠陰莖組織中均有表達，其中ED組的表達量較N組顯著降低（P＜0.05）。干預后，AE、WE、COE和Yimusake組的表達量均較ED組顯著升高（P＜0.05），并顯著高于N組（P＜0.05），各干預組之間則無顯著性差異（P＞0.05），見圖2，表1。

圖2 各組大鼠陰莖組織eNOS免疫組化結果（×400）

（三）nNOS在各組大鼠陰莖組織中的表達結果

nNOS主要表達在海綿體平滑肌及血管壁、海綿竇內皮細胞的細胞漿中，細胞核中亦有表達，陽性表達呈棕黃色。由圖3可見，nNOS在各組大鼠陰莖組織中均有表達，其中，ED組的表達量較N組顯著降低（P＜0.05）。干預后，AE、WE、COE和Yimusake組均較ED組顯著升高（P＜0.05），同時可見，COE組顯著高于WE和N組（P＜0.05），并與Yimusake和AE組間無顯著性差異（P＞0.05），見圖3，表1。

圖3 各組大鼠陰莖組織nNOS免疫組化結果（×400）

二、免疫印跡檢測結果

在24KD、155KD和140KD附近分別檢測出ET-1、nNOS和eNOS各亞型特異性條帶，以GAPDH作為內參，采用軟件定量分析ET-l、eNOS和nNOS的蛋白表達。結果如下：

（一）ET-1在各組大鼠陰莖組織中的表達結果

如圖4所示，ET-1在ED組的表達較N組顯著升高（P＜0.001），干預后，COE和WE組較ED組顯著降低（P＜0.001），同時也顯著低于AE組（＜0.001），且與N組之間無顯著性差異（P＞0.05）。Yimusake和AE組與ED組之間無顯著性差異（P＞0.05），同時顯著高于N組（P＜0.001），見圖4。

圖4 ET-1在各組大鼠陰莖組織中的表達

（二）eNOS在各組大鼠陰莖組織中的表達結果

如圖5所示，eNOS在ED組的表達量較N組顯著降低（P＜0.001），經干預后，COE、AE和Yimusake組較ED組顯著升高（P＜0.001），并且COE、AE和Yimusake組顯著高于N組（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01），同時三組之間無顯著性差異（P＞0.05）。WE組顯著高于ED組，并與N組之間無顯著性差異（P＞0.05），見圖5。

圖5 eNOS在各組大鼠陰莖組織中的表達

（三）nNOS在各組大鼠陰莖組織中的表達結果

如圖6所示，nNOS在ED組的表達量較N組顯著降低（P＜0.001），經干預后，COE、AE和Yimusake組較ED組顯著升高（P＜0.001），并顯著高于N組（P＜0.001），同時三組之間無顯著性差異（P＞0.05），而WE組與ED組之間比較，無顯著性差異（P＞0.05），見圖6。

圖6 nNOS在各組大鼠陰莖組織中的表達

討 論

ED作為男科常見疾病，病因很多且較復雜，據流行病學調查顯示[7]，與ED發病有關的因素包括糖尿病、心血管疾病、肥胖、泌尿系統疾病和精神疾病等，同時，圍繞上述病因所導致的ED方面的研究也相對較多，但是關于環境激素和冷刺激對男性陰莖勃起功能影響的研究較少，故前期工作中，我們以冷刺激聯合環境雌激素樣飼料復合干預的方法建立了復合應激性ED大鼠模型，在對該模型進行綜合評價的基礎上，對其行為學與神經內分泌免疫網絡改變進行過報道[3,8]，隨后，運用蛋白質組學技術，對該模型伊木薩克片干預前后陰莖組織差異表達蛋白及伊木薩克片的調控作用進行了生物信息學分析與報道，得出陰莖組織中血管內皮及平滑肌功能改變可能是復合應激性ED發生發展的關鍵機制，并與炎癥相關，初步確定MAP1、BGN等候選蛋白標志物和伊木薩克片藥物干預的蛋白靶點，但具體的機制尚有待于進一步研究[9]。

陰莖勃起是神經內分泌調節下的一系列血管平滑肌舒張反應，其中血管內皮發揮著關鍵性的作用。中樞和外周神經以及陰莖海綿體內竇隙及血管內皮細胞產生和釋放一些舒張與收縮因子，二者之間的平衡對平滑肌狀態有重要影響[10]。ET-1是目前發現的最強的血管收縮因子之一，主要由血管內皮細胞產生，對于血管具有較強的促進收縮及促進血管平滑肌增殖的作用,且在促進血管平滑肌細胞的增殖分裂的同時,能介導各種平滑肌收縮，包括海綿體平滑肌、尿道海綿體平滑肌等[11]，因此，血管功能異常致ET-1水平升高在ED的病理生理機制中有著重要的作用。而一氧化氮（Nitric Oxide，NO）則是分布在陰莖的副交感和非腎上腺素非乙酰膽堿能神經末梢、血管和陰莖海綿體竇內皮細胞在NOS催化下釋放的一種可溶性氣體分子，為主要的舒血管因子，在激活NO-cGMP通路，誘發陰莖勃起中發揮著關鍵性的作用。本研究結果中免疫組化和免疫印跡結果均顯示，該ED模型陰莖組織中ET-1的表達量較N組顯著升高，而eNOS和nNOS則顯著降低，結果提示，內皮功能受損，并導致ET-1表達升高和NO產生減少可能是復合應激條件下導致ED發生的重要病理機制之一。具體而言，可能和ET-1表達增加，從而進一步激活ETA和ETB受體，并使細胞加速Ca2+內流，導致海綿體平滑肌持續性收縮，血流減少有關。同時，eNOS及nNOS表達降低，導致NO生成減少，平滑肌細胞舒張功能減退，進而產生ED。至于兩者之間是否相互影響，產生協同效應，尚需進一步研究，但有文獻報道[12,13]，ET-1可通過與陰莖組織上的特異性受體結合，加速Ca2+內流，并影響NO的生成，導致陰莖海綿體持續性收縮的同時，還能抑制內皮NO的生物利用度，促進陰莖動脈的收縮，并進而導致ED。

經伊木薩克片和伊木薩克不同提取物及組合物干預后，結果顯示，COE、WE和Yimusake組中ET-1的表達較ED組均顯著降低，同時COE和WE組與N組之間無顯著差異，且顯著低于AE和Yimusake組。提示，COE、WE和伊木薩克片均可通過降低ET-1發揮治療作用，同時COE和WE較AE和伊木薩克片而言調控ET-1效果更顯著。COE、AE和Yimusake組中eNOS及nNOS表達均較ED組顯著升高，并顯著高于N組，同時COE組nNOS表達亦顯著高于Yimusake組，該結果提示，COE、AE和伊木薩克片均可通過升高eNOS和nNOS表達來發揮治療作用，具體可能和進一步激活NO-cGMP通路相關，同時也表明COE調控nNOS的效果優于伊木薩克片。

綜上所述，在復合應激性ED的發生發展中，從陰莖這一效應器官角度而言，陰莖組織中ET-1和eNOS、nNOS表達改變可能是關鍵病理學機制，結合以往的研究，我們認為具體原因可能和復合應激條件下產生慢性炎癥，并進一步引發內皮細胞功能改變有關，但需進一步研究證實。伊木薩克提取物及其組合物，以及伊木薩克片可通過調控ET-1與nNOS、eNOS表達水平來發揮治療作用，經綜合分析，COE的整體調控作用優于伊木薩克片，該結果為伊木薩克的二次研發奠定了基礎。