2019-2020年酒泉市市售羊肉多殺性巴氏桿菌污染情況調查及分析

夏冰芝

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)屬革蘭氏陰性菌，該病原可感染多種經濟動物，其中包括豬、牛、羊和禽等，也可感染人，是重要的人獸共患性致病菌。不同動物感染該病所出現的臨床癥狀差異較大，其中豬感染該病出現豬肺疫或萎縮性鼻炎、牛為敗血癥、禽為霍亂，而羊則表現為流行性肺炎[1]。多殺性巴氏桿菌屬于機會致病菌，其主要寄生在宿主呼吸道和泌尿道粘膜，一般不會導致宿主發病，若外界環境導致宿主免疫力下降，多殺性巴氏桿菌則可導致其出現嚴重的臨床癥狀。人感染巴氏桿菌病案例較少見，多由帶病動物咬傷、抓傷或粘膜傷口接觸病原污染物引起，可導致患者出現局部化膿，甚至腦膜炎等。

多殺性巴氏桿菌具有多個血清型，根據莢膜抗原差異可將其分為5個血清型，分別為A、B、D、E和F；根據脂多糖抗原差異則可將其分為16種血清型；此外，多殺性巴氏桿菌還可被分為產毒多殺性巴氏桿菌和非產毒多殺性巴氏桿菌[2]。甘肅省養羊業發達，近年來甘肅省部分地區羊群出現多殺性巴氏桿菌疫情，給當地養殖業造成巨大的經濟損失[3]。多殺性巴氏桿菌在外界廣泛存在，家畜在飼養、屠宰、運輸和售賣等環節均易感染該病原，消費者食用被病原菌污染的肉類后可能導致食源性疾病，繼而影響健康。隨著人們對食源性疾病防控的重視，對市售肉類食源性病原污染情況調查的研究較多，但大部分研究是針對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等病原，對多殺性巴氏桿菌的研究相對較少[2，4]。

本文從酒泉市部分地區收集市售羊肉樣品共257份，對樣品中多殺性巴氏桿菌污染情況進行檢測，同時對分離的菌株進行莢膜血清型鑒定及耐藥性監測，旨在為該病的防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 于2019年3-9月和2020年5-9月從酒泉市部分地區(肅州區、金塔縣、玉門市和敦煌市)農貿市場、屠宰場和超市采集新鮮市售羊肉樣品257份，其中農貿市場、屠宰場和超市來源樣品數量分別為93份、132份和32份。按照隨機采樣原則，每月中旬左右從各采樣點采集樣品，無菌采集樣品后低溫送至酒泉職業技術學院食品病原檢測實驗室進行檢測。

1.1.2 主要試劑 本研究所需培養基均購自于北京陸橋技術有限公司；PCR反應及凝膠電泳等所需試劑均購自于寶生物工程(大連)有限公司；藥敏紙片均購自于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離及鑒定 取1.0 g左右新鮮羊肉樣品與適量生理鹽水進行研磨，用滅菌接種環蘸取少量上清在含5%馬血清的胰蛋白胨大豆瓊脂培養基上進行劃線，將培養基放在37 ℃恒溫箱中培養24 h，挑取單一、疑似多殺性巴氏桿菌菌株進行革蘭氏染色鑒定，并將其置于含5%馬血清胰蛋白胨大豆肉湯培養基中進行增菌。

1.2.1.1 分離菌株16S rRNA基因分子鑒定 取少量擴增菌液煮沸，以上清為DNA模板，根據參考文獻[5]合成鑒定多殺性巴氏桿菌16S rRNA基因引物 (表1)，以PCR法對本研究獲得的菌株的16S rRNA基因序列進行擴增。PCR體系(25.0 μL)中包括PCR預混液12.5 μL、上下游引物各1.0 μL、模板DNA樣品2.0 μL和DPEC處理水8.5 μL。每個PCR反應均設置陽性和陰性對照，其模板分別為已知多殺性巴氏桿菌分離株核酸和去離子水。擴增條件為95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共36個循環；72 ℃ 5 min。PCR反應結束后取5.0 μL產物進行凝膠電泳，并觀察結果。將陽性產物送至生工生物工程(上海)有限公司進行雙向測序，其后將測序結果拼接后在NCBI網絡進行核苷酸序列BLAST比對。

1.2.1.2 分離菌株莢膜血清學型分子鑒定 根據參考文獻[6]合成鑒定多殺性巴氏桿菌和莢膜血清學型的特異性引物 (表1)，通過PCR法鑒定分離菌株的莢膜血清型。PCR體系(25.0 μL)中包括PCR預混液12.5 μL、上下游引物各1.0 μL、模板DNA樣品2.0 μL和DPEC處理水8.5 μL。擴增條件為95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共36個循環；72 ℃ 5 min。PCR反應結束后取5.0 μL產物進行凝膠電泳，并觀察結果。

表1 多殺性巴氏桿菌16S rRNA基因及莢膜血清型鑒定引物序列及目的片段大小信息Tab.1 Information on primer sequences and target fragment sizes for capsular serotype identification of Pasteurella multocida

1.2.2 藥敏試驗 采用Kirby-Bauer法對本研究獲得的菌株分別進行藥敏試驗。將菌液稀釋至濃度為1.0×108cfu/mL，取100 μL稀釋菌液均勻涂布在含5%馬血清的胰蛋白胨大豆瓊脂培養基表面，待表面菌液稍干后在每個培養基表面貼上4種不同的藥敏紙片，做好標記后將培養基置于37 ℃恒溫箱培養24 h，其后測定菌株對含有不同抗生素藥敏紙片的抑菌圈。參考CLSI標準結合杭州濱和微生物試劑有限公司提供藥敏判讀標準[7]判定菌株對抗生素是否敏感、中介或耐藥。

1.2.3 小鼠致病性試驗 根據分子鑒定結果，從多殺性巴氏桿菌A型、B型和D型中分別選2個分離株進行小鼠致病性試驗。將菌液濃度稀釋為1×107cfu/mL。將42只6周齡雌性昆明小鼠隨機分為7組(6個試驗組和1個對照組)，每組6只。對試驗組小鼠腹腔注射200 μL稀釋菌液，對照組小鼠腹腔注射200 μL生理鹽水。每日觀察各組小鼠臨床癥狀及死亡情況。

2 結 果

2.1 羊源多殺性巴氏桿菌細菌分離及鑒定 用滅菌接種環蘸取少量組織液在平板上進行細菌分離，24 h后發現部分樣品培養基表面長有針尖狀、(半)透明的菌落；將單一菌落進行革蘭氏染色并鏡檢，結果發現有1種兩端鈍圓、中間稍微突起的短桿菌，且為革蘭氏陰性菌，可將其初步鑒定為多殺性巴氏桿菌。為進一步對其進行分子鑒定，我們以PCR法對隨機挑選的12份陽性樣品(多殺性巴氏桿菌分離株)基因組中16S rRNA基因序列進行擴增與測序分，結果發現，12個分離株16S rRNA基因片段擴增產物大小為1 502～1 509 bp，進一步同源性分析發現以上分離株均為多殺性巴氏桿菌。

2.2 酒泉市部分地區市售羊肉多殺性巴氏桿菌污染情況調查結果 通過對257份市售羊肉樣品進行細菌分離與鑒定，發現樣品中多殺性巴氏桿菌檢出率為6.22%(16/257)。進一步統計結果如表2，被調查的4個地區中以金塔縣來源樣品多殺性巴氏桿菌檢出率最高，為9.3%(4/43)，其次為肅州區(7.62%)，而玉門市和敦煌市相對較低，分別為3.45%(2/58)和4.62%(3/65)；2019年采集的羊肉樣品多殺性巴氏桿菌檢出率較2020年高出近1.5倍，分別為9.17%(11/120)和3.65%(5/137)；此外，農貿市場/超市和屠宰場來源樣品中病原檢出率存在差異，分別為8.49%(9/93)、4.55%(6/132)和3.13%(1/32)。以上調查結果表明，酒泉市市售羊肉樣品中存在多殺性巴氏桿菌污染情況，這無疑對消費者健康造成較大的威脅。

表2 酒泉市部分地區市售羊肉多殺性巴氏桿菌污染情況調查結果Tab.2 Investigation results of Pasteurella multocida contamination in mutton sold in several areas of Jiuquan City

2.3 多殺性巴氏桿菌血清型鑒定結果 以煮沸菌液上清DNA為模板，分別用多殺性巴氏桿菌莢膜血清型特異性引物以PCR法進行擴增，將PCR產物進行凝膠電泳。結果如表3，16個多殺性巴氏桿菌分離株中含有血清A、B和D型，未鑒定出E型和F型，對應菌株數量分別為9、5和2株，所占比例分別為56.25%、31.25%和12.50%。由此可見，該地區市售羊肉中多殺性巴氏桿菌血清型較為復雜，且A型為主要優勢種。

表3 多殺性巴氏桿菌血清型鑒定結果Tab.3 Serotype identification results for Pasteurella multocida

2.4 多殺性巴氏桿菌分離株耐藥性檢測結果 對本文獲得的16個多殺性巴氏桿菌分離株進行耐藥性檢測與統計。其結果如表4，分離株對14種常見抗生素耐藥率為0%～100%，其中對林可霉素和磺胺甲氧嘧啶耐藥率最高，分別為100%(16/16)和81.25%(13/16)；對氟苯尼考、氯霉素、頭孢唑林和頭孢他啶相對敏感，其耐藥率分別為0.0%(0/16)、12.5%(2/16)、0.0%(0/16)和6.25%(1/16)。

表4 多殺性巴氏桿菌分離株耐藥性檢測結果Tab.4 Drug resistance test results for Pasteurella multocida isolates

2.5 不同血清型多殺性巴氏桿菌小鼠致病性試驗結果 與對照組相比，部分試驗組小鼠在接種對于菌株3 h后出現明顯臨床癥狀，主要表現為精神萎靡、不好動。血清型B多殺性巴氏桿菌-2(B-2)組小鼠在接種6 h后死亡1只，其后不同組部分小鼠均出現死亡現象，截至接種后30 h，A-1、A-2、B-1和B-2組小鼠全部死亡，而D-1和D-2組小鼠死亡率分別為50.0%和66.7%。對死亡小鼠進行解剖，發現小鼠心包周圍有纖維性滲出，同時有肺出血，對血液樣品進行涂片鏡檢，發現有類似多殺性巴氏桿菌形態學特征的菌株。以上結果說明，A-1、A-2、B-1和B-2分離株較D-1和D-2分離株對小鼠的致病性強。

3 討 論

多殺性巴氏桿菌為重要人獸共患性病原，該病原感染人可導致病患出現發熱、痙攣和出汗等癥狀，給患者健康造成一定威脅。人主要因動物咬傷而感染多殺性巴氏桿菌病，但食用被病原污染的肉類也具有感染風險。多殺性巴氏桿菌可感染多種宿主，且該病原在環境中廣泛存在，而肉類在屠宰、運輸和售賣過程中易受到病原污染，食用被該病原污染的肉類對消費者健康具有潛在威脅。已有報道表明我國市售肉類食源性細菌污染情況較為嚴重[2，4，7-9]，但針對市售肉類多殺性巴氏桿菌污染情況的調查較為少見。

羊肉因味道鮮美而受到廣大消費者的喜愛，同時羊養殖業也是酒泉市農業發展的支柱性產業。本文旨在初步了解酒泉市市售羊肉多殺性巴氏桿菌污染情況，結果發現該地區被調查樣品中巴氏桿菌檢出率為6.22%(16/257)，其結果提示該地區市售羊肉中存在多殺性巴氏桿菌污染的情況，而該病原可通過傷口進入患者體內，故從事羊肉加工、運輸和售賣的相關從業人員在工作時應注意自身防護。進一步統計結果發現2019年來源樣品多殺性巴氏桿菌檢測陽性率高于2020年，分別為9.17%和3.65%，筆者猜測由于新冠肺炎導致相關從業人員提高了對肉類的衛生管理水平，羊在飼養過程中感染多殺性巴氏桿菌的陽性率相對較低，可能其在屠宰、加工、運輸和售賣過程會被該致病菌污染；且農貿市場來源樣品較屠宰場、超市來源樣品陽性率高出許多，這也進一步證實了我們的猜測，因為農貿市場來源的肉類在運輸和售賣過程環境中致病菌更多，導致致病菌污染肉類概率也更大，這也提示在肉類運輸和售賣過程中應注意衛生管理。

多殺性巴氏桿菌含有多個血清型，其中導致牛羊出現肺炎的多殺性巴氏桿菌主要為莢膜A血清型[10]，但其它血清型病原也可感染牛羊。劉海燕等研究中發現四川山羊多殺性巴氏桿菌莢膜血清型主要為A型和B型[7]，而王巍等首次在呼倫貝爾病羊中分離出莢膜血清型D型多殺性巴氏桿菌[11]。本研究以特異性PCR法對分離的菌株進行莢膜血清型鑒定，發現16個菌株中有9株為A型，5株為B型，2株為D型，但未檢測到E和F型，提示該地區羊群流行的多殺性巴氏桿菌血清型較為復雜，這可能與肉類在運輸和售賣過程環境污染有關。此外，進一步動物試驗表明，隨機挑選的血清型A型和B型多殺性巴氏桿菌較D型對小鼠的致病性更高，但其中原因還有待進一步研究。

目前對羊多殺性巴氏桿菌的防制主要依賴于抗生素的大量使用，但這也導致大量耐藥株的出現。劉海燕等研究結果發現四川地區分離的羊多殺性巴氏桿菌對林可霉素和青霉素耐藥率為100.0%，但其對氟苯尼考和復方新諾明等較為敏感[5]；井郁金等發現新疆地區綿羊源多殺性巴氏桿菌對頭孢拉定、替米考星等敏感，但對林可霉素和阿米卡星高度耐藥[11]。本研究結果發現酒泉地區羊源多殺性巴氏桿菌對氟苯尼考、氯霉素等抗生素高度敏感，但對林可霉素耐藥率達100%，這與他人研究基本一致[5,11]，這同時也說明該地區羊源多殺性巴氏桿菌對不同抗生素耐藥程度較高，應引起相關養殖戶的重視。