1例由臍血血紅蛋白電泳追溯到的罕見型新生兒β珠蛋白生成障礙性貧血基因家系分析*

王柏蓮，黃珍艷，李 瓊，唐 勇

(廣西醫科大附屬武鳴醫院醫學檢驗科，南寧 530199)

珠蛋白生成障礙性貧血是我國南方地區高發的遺傳性溶血性疾病，也是南方地區重點防治的單基因遺傳性疾病。常見有α和β兩大類。β珠蛋白生成障礙性貧血是由于β珠蛋白基因異常導致β珠蛋白鏈合成減少或缺乏所引起的溶血性疾病。目前臨床上β珠蛋白生成障礙性貧血基因的檢測主要檢測中國常見的17種位點突變：CD41-42、CD43、IVS-Ⅱ-654、CD-28、CD-29、CD-30、CD-32、CD71-72、CD26(βE)、CD17、CD31、CD14-15、CD27-28、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、Cap+40-43和IntM[1]。β珠蛋白生成障礙性貧血具有較大的遺傳異質性和臨床表型異質性,存在地域性和民族分布差異[2],如果只對常見基因突變類型進行檢測則會造成罕見和稀有突變類型漏檢。尤其在孕前和孕期的臨床診療中，應考慮更全面的珠蛋白生成障礙性貧血檢測方法如一代測序(Sanger測序)、二代測序(NGS)和多重探針擴增技術(MLPA)。若能將各種常見或罕見突變基因型分別納入常規檢測，則能有效避免珠蛋白生成障礙性貧血在臨床上的漏診和誤診，對臨床診治和遺傳咨詢具有重要意義[3]。本研究從1例新生兒臍血血紅蛋白電泳結果中，通過常見基因型檢測和基因測序發現患兒不僅攜帶常見型β珠蛋白生成障礙性貧血基因CD41-42，還攜帶有目前國內未曾報道的罕見型β珠蛋白生成障礙性貧血基因CD52(GAT>GTT)位點，對其進行家系調查、遺傳學特征分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

先證者男，年齡 7 h，廣西馬山縣人，2018年2 月13日在廣西醫科大學附屬武鳴醫院產科足月順產出生，娩出后收集臍帶血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，立即送達醫學檢驗科置2～8 ℃冰箱保存備用。采用法國Sebia Capillarys2全自動電泳儀及其配套試劑，按照儀器操作說明書進行檢測。結果發現先證者HbA水平為0，通過查詢住院病歷資料，先證者在胎兒期到外院抽取羊水做產前診斷的基因型為β41-42/βN，與目前的表型HbA水平為0、HbF水平為93.7%不相符，進一步做珠蛋白生成障礙性貧血基因DNA測序，結果基因型為β41-42/β52雙重雜合子。聯系患兒父母在獲得知情同意下獲取了患兒父母及其姐姐的血液樣本進行常見珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測和基因測序。

1.2 方法

1.2.1常規血液檢測

收集先證者臍血和其父母、姐姐外周靜脈血3.0 mL，EDTA-K2抗凝，用邁瑞BC-6800全自動五分類血細胞分析儀，按照儀器操作說明書檢測紅細胞參數[紅細胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)、紅細胞平均壓積體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白水平(MCH) 等]。

1.2.2血紅蛋白毛細管電泳分析

采用法國Sebia Capillarys2全自動電泳儀按照儀器操作說明書進行血紅蛋白分析。

1.2.3常見珠蛋白生成障礙性貧血基因型檢測

試劑由潮州凱普公司提供，采用導流雜交技術進行常見型α和β珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測，包括常見的3種缺失和3種非缺失型α珠蛋白生成障礙性貧血，17種常見β珠蛋白生成障礙性貧血點突變。實驗步驟嚴格按試劑說明書進行。

1.2.4罕見珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷

采用多重鏈接探針技術(MLPA)、DNA測序、缺口PCR(Cap-PCR)、三聯體電泳及血紅蛋白持續性增多癥缺失型電泳等技術進行檢測。標本送到廣州潮州凱普公司進行檢測。

2 結 果

2.1 家系成員血液學表型分析

先證者、父母、姐姐的血常規檢測表現為小細胞、低色素，先證者血紅蛋白毛細管電泳分析結果：HbA水平為0、HbF水平為93.7%(正常新生兒臍血HbA水平為12%～14%、HbF水平為60%～88%)，同時發現一條異常血紅蛋白性慢速帶，水平為6.1%；母親血紅蛋白毛細管電泳結果為：HbA水平為0、HbF水平為8.4%、HbA2水平為6.9%，發現一條異常血紅蛋白性慢速帶，水平為84.7%，母親在外院做產前篩查時用美國Bio-Rad VARIANTTMⅡ血紅蛋白分析系統檢測的結果HbA水平為13.4%、HbF水平為10.3%、HbA2水平為76.3%；父親的結果為HbA2水平為5.4%、HbF水平為1.1%；姐姐的結果為HbA水平為0、HbF水平為5.5%、HbA2水平為6.4%發現一條異常血紅蛋白慢速帶水平為88.1%。根據患者基因型和表型的資料，考慮到先證者、母親及姐姐應該還攜帶有常見型β珠蛋白生成障礙性貧血基因以外的其他突變點。該家系表型結果見表1。

表1 先證者及家人表型分析結果

2.2 常見珠蛋白生成障礙性貧血基因型診斷

多重PCR反向斑點雜交法(PCR-RDB)檢測結果顯示先證者基因型為β41-42/βN，其父親基因型為β41-42/βN，其母親基因型為β17/βN，姐姐基因型為β141-42/βN。

2.3 基因測序結果

先證者β基因測序結果為：CD41-42(-TTCT,41-42M)雜合復合CD52(GAT>GTT)雜合突變的β珠蛋白生成障礙性貧血雙重雜合突變，α基因未見突變；其父親測序結果為：CD41-42(-TTCT,41-42M)位點雜合突變β珠蛋白生成障礙性貧血，α基因未見突變；其母親測序結果為：CD17(AAG>TAG,17M)雜合突變復合CD52(GAT>GTT)雜合突變的雙重雜合子，α基因未見突變。姐姐測序結果與先證者結果一致。從家系分析證實，先證者及其姐姐罕見突變CD52(GAT>GTT)來自母親。測序結果見圖1。

A：先證者和其姐姐基因測序結果，β基因CD41-42(-TTCT,41-42M)合并CD52(GAT>GTT)雙重雜合突變；B：母親基因測序結果，β基因CD17(AAG>TAG,17M)合并CD52(GAT>GTT)雙重雜合突變；C：父親基因測序結果，β基因CD41-42(-TTCT,41-42M)突變。

3 討 論

一般正常新生兒的HbF約占70%，HbA約占30%，HbA2少于1%[4]。全自動毛細管血紅蛋白電泳分析技術，利用高電壓作用下，在直徑為25 μm的毛細管中實現不同血紅蛋白組分的分離。該技術對各種血紅蛋白組分檢測敏感、穩定，可準確地檢測并定量各種血紅蛋白組分如：HbBart′s、HbA、HbF、HbA2和部分異常血紅蛋白等[5-8]，是目前新生兒珠蛋白生成障礙性貧血篩查最簡便且最有效的技術[9]。根據國內外對新生兒珠蛋白生成障礙性貧血篩查研究[10-13]，β珠蛋白生成障礙性貧血患兒由于β珠蛋白生成障礙，其HbA水平低于正常新生兒，且HbA水平越低，提示β珠蛋白生成障礙性貧血越嚴重，因此臨床常利用HbA水平初步篩查β珠蛋白生成障礙性貧血[12]。本研究先證者新生兒臍血毛細血管血紅蛋白電泳HbA完全缺乏，考慮重型珠蛋白生成障礙性貧血；而常規基因檢測為β41-42雜合突變，屬于輕型β珠蛋白生成障礙性貧血，與表型不相符。提示極有可能還有其他類型β珠蛋白生成障礙性貧血基因點突變，有必要采用其他方法進一步確定突變位點。通過DNA測序，檢測到罕見型β珠蛋白生成障礙性貧血CD52(GAT>GTT)位點雜合突變。CD52(GAT>GTT)位點突變β基因編碼區序列的158號堿基A突變為T，即HBB:c.158A>T，對應的編碼氨基酸由天冬氨酸改為纈氨酸的一種異常血紅蛋白。查詢HbVar數據庫參考信息，該異常血紅蛋白曾于2000年6月發現于美國土著的1位法國和波蘭血統的嬰兒，為雜合突變，文獻報道提示臨床表現正常；本例先證者屬于中重度貧血，是否由于異常血紅蛋白復合珠蛋白生成障礙性貧血時，表現為中間型或重型珠蛋白生成障礙性貧血[13]，或者表明臨床表型不僅僅取決于基因型，還可能與種族差異和遺傳修飾基因有關[14]，由于該突變文獻報道有限，其致病性有待更多的案例納入研究才能夠明確。本研究家系成員中，先證者及母親、姐姐血液學表型表現為典型的β0/β+中間型珠蛋白生成障礙性貧血。

β珠蛋白生成障礙性貧血分子基礎復雜，既有很大的遺傳異質性和臨床表型異質性,又有民族和地域性差異,廣西南寧主要以CD41-42為主[15]，海南報道較多的是CD41-42、IVS-Ⅱ-654、CD71-72[16]。常規珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測試劑盒只能檢測覆蓋中國人常見突變類型的95%～98%。在臨床實踐工作中，必須遵循“基因與表型相結合”這一基本原則,當表型和基因型不相符時,應進行罕見型珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測以明確其基因型，防止漏診和誤診。目前對罕見型珠蛋白生成障礙性貧血基因缺失檢測可采用Cap-PCR和MLPA等方法，而位點突變可通過DNA測序技術進行鑒定，隨著檢測技術的進步,可檢測到的更多突變類型，尤其是一些稀有類型突變[17],對豐富珠蛋白生成障礙性貧血基因突變數據庫,更好地指導臨床診治和遺傳咨詢具有重要意義。