夏枯草對膠質瘤U87細胞凋亡與增殖的影響?

杜 康， 曹 勇， 劉 彪， 謝 磊， 鄭慧軍

(1.河南中醫藥大學， 鄭州 430052；2.河南中醫藥大學第二附屬醫院神經外科，鄭州 430052)

膠質瘤是顱內發病率最高的惡性腫瘤，主要治療方式為手術、放化療[1]，但患者5年生存率仍然較低，且副作用較大。已有報道，夏枯草對乳腺癌、甲狀腺癌、食管癌等多種惡性腫瘤具有良好的治療作用[2，3]，但對膠質瘤的治療作用尚無研究。本實驗擬考察夏枯草溶液對膠質瘤U87細胞增殖與凋亡的影響。本研究已通過河南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查。

1 材料與方法

1.1 藥物

夏枯草配方顆粒，購自四川新綠藥業有限公司(5 g/盒)

1.2 腫瘤細胞及實驗動物

膠質瘤U87細胞(以下簡稱瘤細胞)購自上海中國科學院細胞庫。雄性小鼠裸鼠，4周齡，購自南京醫科大學動物中心。實驗前所有裸鼠(BALB/cA-nu)在無病毒(SPF)環境中飼養，室溫為26 ℃～28 ℃(78～820F)，相對溫度保持在40%～60%，每日約維持10 h光照，14 h無光的明暗周期，提供無菌食物和水(所有操作均在無菌條件下進行)。動物實驗開始之前，將裸鼠(BALB/cA-nu)按體質量隨機分為模型組、夏枯草低、中和高劑量組，在新的環境中飼養1周。

1.3 試劑

MEM培養基(博士德生物科技有限公司)；Phosphate Buffered Saline(Biological Industries)；胎牛血清(Biological Industries)；青鏈霉素雙抗混合液(Beijing Solarbio)；CCK-8試劑盒(上海同仁化學科技有限公司)；凋亡試劑盒(凱基生物)；BCA蛋白測定盒(武漢博士德生物技術有限公司)；Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9、Ki-67單克隆抗體均購自武漢三鷹生物技術有限公司；PCR逆轉錄試劑盒(大連寶生生物工程有限公司)；mRNA提取試劑盒(上海生工生物有限公司)；Bcl-2、Bax、Caspase-3及Caspase-9的引物均委托上海生工生物有限公司合成。

1.4 實驗儀器

CO2恒溫培養箱(HERAcell160i-美國Thermo Scientific HERAcell160i CO2培養箱)；流式細胞儀(美國BD FACSJazz)；超微量核酸蛋白測定儀(中國One Drop 公司 Nano Drop One/One C)；酶標儀(賽默飛世爾(上海)儀器有限公司 318C)；基因擴增儀(美國BIO-RAD公司 T100)；蛋白凝膠成像系統(BIO RAD Industries ChemiDoc XRS)。

1.5 實驗方法

1.5.1 夏枯草溶液的制備 將10 g夏枯草配方顆粒溶于20 ml MEM培養基中超聲波震蕩15 min，4 ℃ 1200 r/min離心10 min，保留上清液，以0.22 μm孔徑的無菌濾器過濾，-20 ℃層凍存，夏枯草濃度約為40 mg/ml(生藥/ml)。

1.5.2 膠質瘤U87細胞培養 將膠質瘤U87細胞放入恒溫培養箱(37 ℃、5%CO2)中培養12 h，以胰酶消化并離心，按1×106個細胞密度接種于25 cm2培養瓶中，加入MEM培養液(含10%胎牛血清，1%青鏈霉素雙抗混合液)4 ml，放入恒溫培養箱中培養(37 ℃、5%CO2)，待膠質瘤U87細胞長滿瓶底進行傳代(約每48～72 h傳1次)，取對數生長期的膠質瘤U87細胞進行實驗。

1.5.3 膠質瘤U87細胞分組 將膠質瘤U87細胞接種在96孔板中，將其分為6組，每組設6個復孔。對照組正常培養液培養；夏枯草低、中和高劑量組將夏枯草溶液采用培養液進行稀釋，使得每孔的終濃度分別為0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml。

1.5.4 平板克隆實驗檢測夏枯草藥物對細胞增殖的影響 將膠質瘤U87細胞按照每孔800個細胞接種于6孔板，加入夏枯草低、中和高劑量，5%CO2，37 ℃的培養箱中培養14 d，結晶紫溶液染色后于顯微鏡下行各組細胞集落計數。

1.5.5 CCK-8檢測夏枯草藥物毒性對細胞增殖的影響 將膠質瘤U87細胞按照每孔1×104個細胞接種于96孔板，5%CO2，37 ℃的培養箱中培養24 h，向96孔板中加入夏枯草低、中和高劑量溶液，每個濃度設6個復孔。24 h后每孔中加入10 μl CCK-8溶液，10 min后分別用酶標儀檢測各組在450 nm處的吸光度值。

1.5.6 顯微鏡下對膠質瘤U87細胞生長狀態觀察 各組細胞培養加藥干預24 h后，倒盡培養基，采用PBS洗2遍，常溫干燥，采用75%乙醇固定，5%結晶紫溶液染色2 h，顯微鏡下觀察，計數各組細胞聚集成團的個數，≥50個細胞為1個細胞集落。

1.5.7 流式細胞儀檢測U87細胞凋亡率 各組細胞培養加藥干預24 h后，用不含EDTA的0.25%胰酶消化，按照每管1×105～5×105個細胞，收集至2 ml離心管中，2000r/min離心5 min，加入1.5 ml PBS液洗滌細胞，2000r/min離心5 min，重復上述洗滌操作2遍。依次加入500 μl的Binding Buffer懸浮細胞、5 μl Annexin V-FITC、5 μL Propidium lodide混勻。室溫下避光反應5～15 min，反應完成后在1 h內完成流式細胞儀對各組膠質瘤U87細胞凋亡率的檢測。

1.5.8 RT-PCR檢測膠質瘤U87細胞凋亡基因的表達 細胞加藥干預24 h后，提取細胞總RNA，測定細胞總RNA濃度及純度。對RNA進行逆轉錄：以1 μg RNA合成的cDNA，以GAPDH作為內參基因，分別擴增Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9基因。當基因擴增反應結束時，從65 ℃緩慢加熱至95 ℃，將PCR溶解產物的溶解曲線建立。采用2-△△CT相對定量法，計算各組基因的表達情況，同時對各組數據進行進行統計分析。

1.5.9 Western Blot檢測凋亡相關蛋白 各組細胞培養加藥干預24 h后，提取細胞總蛋白，蛋白定量、配置蛋白膠，蛋白上樣電泳，蛋白轉膜后進行封閉，抗體孵育。孵育完成后，將蛋白膜放入ECL發光液中搖動3 min，利用Image Lab系統進行曝片，以GAPDH作為內參，檢測各組Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9凋亡相關蛋白表達。

1.5.10 小鼠皮下成瘤模型建立、給藥及指標檢測 將4周大的雄性小鼠裸鼠(BALB/cA-nu)按體質量隨機分為模型組、夏枯草低、中和高劑量組4組，分別為1.8 g/kg組、3.6 g/kg組、5.4 g/kg組每組各4只。將U87細胞(每側1×106細胞/100μl)皮下注射到小鼠側腹。接種后每隔1 d按組別給小鼠灌胃給藥，給藥容積為0.1 ml/10 g，對照組灌胃給予生理鹽水。每6 d測量腫瘤大小，持續30 d(給藥15 d)。使用公式(width2×length)/2計算腫瘤體積。30 d后對小鼠實行安樂死取皮下瘤，行Ki-67免疫組化染色，Ki-67染色陽性細胞百分率即為增殖指數。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 夏枯草對瘤細胞增殖的影響

圖1示，與對照組比較，夏枯草組的瘤細胞集落數量減少、活性降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性降低，說明夏枯草可抑制瘤細胞增殖。

注：A.平板克隆實驗；B.細胞集落數量；C.CCK-8檢測；NC.對照組；1.夏枯草低劑量組；2.夏枯草中劑量組；3.夏枯草高劑量組；與對照組比較：*P<0.05；與夏枯草低劑量組比較：%P<0.05；與夏枯草中劑量組比較：&P<0.05

2.2 夏枯草對瘤細胞生長狀態的影響

圖2示，對照組瘤細胞成團約2～3個，夏枯草低劑量組成團約0～1個，夏枯草中及高劑量組均未見成團，隨著夏枯草劑量增加，細胞數量有減少趨勢，表明夏枯草可抑制瘤細胞增殖。

注：NC.對照組；1.夏枯草低劑量組；2.夏枯草中劑量組；3.夏枯草高劑量組

2.3 流式細胞術檢測夏枯草誘導瘤細胞凋亡

圖3示，與對照組比較，夏枯草組的凋亡細胞數增多(P<0.05)，且劑量呈依賴性增高趨勢。

注：與對照組比較：*P<0.05；與夏枯草低劑量組比較：%P<0.05；與夏枯草中劑量組比較：&P<0.05；NC.對照組；1.夏枯草低劑量組；2.夏枯草中劑量組；3.夏枯草高劑量組

2.4 夏枯草對Bax、Bcl-2、Caspase-3(Cleaved-Caspase-3)、Caspase-9(Cleaved-Caspase-9)及Bcl-2表達的影響

圖4示，與對照組比較，夏枯草組的Bax mRNA及蛋白、Caspase-3、Caspase-9 mRNA、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表達均增加，Bcl-2 mRNA及蛋白表達均降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性趨勢。夏枯草溶液可調節凋亡相關因子，如Bax、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9及Bcl-2表達促進瘤細胞凋亡。

注：與對照組比較：*P<0.05；與夏枯草低劑量組比較：%P<0.05；與夏枯草中劑量組比較：&P<0.05；NC.對照組；1.夏枯草低劑量組；2.夏枯草中劑量組；3.夏枯草高劑量組

2.5 夏枯草對在小鼠皮下成瘤的抑制作用

圖5示，與模型組比較，夏枯草組皮下瘤體積均降低，皮下瘤Ki-67表達及增殖指數均降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性降低趨勢。

注：與對照組比較：*P<0.05；與夏枯草低劑量組比較：%P<0.05；與夏枯草中劑量組比較：&P<0.05；MODEL.模型組；1.夏枯草低劑量組；2.夏枯草中劑量組；3.夏枯草高劑量組

3 討論

夏枯草通過促進癌細胞凋亡，抑制癌細胞的增殖與遷移，達到對多種惡性腫瘤的抗癌效果[4]。本研究分別以瘤細胞及該細胞接種的裸鼠為研究對象，結果顯示夏枯草可抑制膠質瘤細胞及瘤組織的增殖，均呈劑量依賴性關系，也印證了文獻的觀點。

夏枯草的抗癌機制較復雜[5，6]，一是夏枯草提取物可以通過P53通路促進畸胎瘤細胞的凋亡，抑制其增殖；二是夏枯草可提高結腸癌細胞對氟尿嘧啶的敏感性，提高結腸癌細胞的凋亡率；三是夏枯草的乙醇提取液可以促進結腸癌細胞的凋亡，抑制膠質瘤細胞的增殖。本實驗將瘤細胞與夏枯草低、中和高劑量共培養24 h，夏枯草組的瘤細胞集落數量逐漸減少，細胞活性降低，凋亡細胞數增多，凋亡相關基因Bax、Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達增加，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達降低，凋亡相關基因Bax、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表達均增加，Bcl-2 蛋白表達降低，均呈夏枯草劑量依賴性趨勢。小鼠皮下瘤體積試驗示，與模型組比較，夏枯草組皮下瘤體積均降低，皮下瘤Ki-67表達及增殖指數均降低，提示夏枯草可用于治療膠質瘤，與其所含的有效成分相關[7-9]。如夏枯草含有大量β-谷甾醇、豆甾醇、菠甾醇及槲皮素且均有明確的抗癌效果，其口服生物利用度≥36%；夏枯草所含的齊墩果酸可調節Caspase-3途徑或抑制MAPK/ERK 信號通路，抑制顱內膠質瘤增殖、遷移和侵襲。

文獻報道，將夏枯草注射液用于治療臨床惡性腫瘤患者，提示夏枯草口服難以通過血腦屏障[10]。劉泰[11]等將夏枯草納入傳統方劑五苓散中，夏枯草具有保護血腦屏障及消除腦血管源性水腫等效果，提示夏枯草有效成分可穿越血腦屏障。盡管本研究顯示，夏枯草灌胃給藥可降低小鼠皮下成瘤的體積，抑制促瘤蛋白Ki-67表達及增殖指數，尚無明確數據證實膠質瘤血腦屏障對夏枯草發揮抗癌效果。

夏枯草通過調控Bax mRNA及蛋白、Bcl-2 mRNA及蛋白、Caspase-3 mRNA、Caspase-9 mRNA、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9表達抑制膠質瘤U87細胞增殖，促進凋亡，且呈夏枯草劑量依賴性趨勢。