濕熱證動物模型造模方法的文獻挖掘研究?

陳佳美， 朱 青,2， 樸勝華,2△， 郭 姣,2

(1.廣東藥科大學，廣東省代謝病中西醫(yī)結合研究中心， 廣州 510006；2.廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點實驗室， 廣州 510006)

濕熱證是臨床常見證候，以身熱不揚、口渴不欲多飲、大便泄瀉、小便黃、舌紅苔黃膩、脈滑數等為主要表現，以病情纏綿、病程較長為特點。《中醫(yī)內科學》載病76種21種疾病[1]。既往濕熱證與急性感染性疾病關系密切，如急性病毒性肝炎[2]、急性胰腺炎[3]、登革熱[4]等。近年來，隨著疾病譜的改變，濕熱證越來越多見于慢性非傳染性疾病[5]，如2 型糖尿病及其并發(fā)癥[6，7]、慢性肝病[8]、慢性胃炎[9]、腎炎[10]等。但濕熱證參與疾病進展的生物學基礎尚不清楚，公認的、可以模擬臨床的濕熱證動物模型的構建，是開展相關研究的基礎工作和關鍵環(huán)節(jié)之一。

自1988年，郭金龍首次通過肥甘飲食和人工濕熱環(huán)境成功模擬濕阻證[11]，后續(xù)學者在此基礎上不斷改進。濕熱證動物模型涉及到動物種類、干預因素、評價指標等多方面，具體方法多達數十種，但目前尚無公認、成熟的濕熱證造模方法，因此亟需對目前已發(fā)表文獻中濕熱證動物模型造模方法進行系統的梳理和分析。基于此，本研究通過提取近20年濕熱證動物模型文獻中的文本信息，從動物種類、干預因素、相關疾病、評價指標等幾方面進行文本信息挖掘，以期為濕熱證造模方法提供客觀數據支撐。

1 濕熱證動物模型文獻發(fā)表數量及機構分布情況

濕熱證動物模型文獻發(fā)表數量統計分析表明，2000年前濕熱證動物模型相關文獻研究較少，從2000年逐漸增多，2005～2014的10年間文獻發(fā)表數量激增，但近5年文獻數量又呈現下降趨勢(見圖1)。濕熱證動物模型研究機構的構成分析表明，濕熱證動物模型研究機構不僅包含廣州中醫(yī)藥大學、遼寧中醫(yī)學院、成都中醫(yī)藥大學等傳統中醫(yī)藥大學,也包括南方醫(yī)科大學、成都軍區(qū)總醫(yī)院等綜合性醫(yī)學院校或機構(見圖2)。

圖1 濕熱證文獻的發(fā)表時間(年)與數量

圖2 濕熱證模型涉及機構分布

2 濕熱證動物模型相關參數

2.1 動物選擇

圖3-5示，濕熱證動物模型的動物種類、年齡和性別的統計分析表明，濕熱證動物模型動物種類涉及到SD大鼠、豚鼠、新西蘭兔等8種動物，以sprague-dawley(SD)大鼠最常見；性別以雌雄各半應用最廣，總體上雄性高于雌性。對濕熱證大鼠年齡進行統計，體質量成為年齡的替代指標，體質量集中在180～220 g之間，以190～200 g區(qū)間頻次最多。

圖3 濕熱證動物模型種類使用情況頻次分布

圖4 濕熱證動物模型性別分布

圖5 濕熱證大鼠初始體質量情況分布

2.2 濕熱證動物模型的干預因素

表1圖6示，濕熱證的誘因包括內濕、外濕、體質、外邪和化學因素。其誘因的相關干預因素統計分析表明，濕熱證干預因素以高脂高糖飲食、濕熱環(huán)境、病毒/細菌、酒精、中藥干預、化學因素為常見，其占比分別為92.1%、91.3%、66.1%、22.8%、9.4%、8.6%；其他因素占2.3%，包括游泳，冷水浸泡等。

表1 濕熱證模型涉及的相關干預方法

圖6 濕熱證模型干預因素頻次分布

濕熱環(huán)境的溫度、濕度分析表明，溫度以32 ℃使用頻率最多，其次是35 ℃(見圖7)，相對濕度以95 %使用頻率最多(見圖8)。對生物因子種類進行統計發(fā)現，大腸埃希菌使用次數最多(見圖9)。僅少數文獻對飲食的配方進行詳細描述，但文獻分析中發(fā)現，濕熱證動物模型飲食的物理狀態(tài)各有不同，分析發(fā)現固態(tài)高脂高糖飼料使用最廣泛(見圖10)。

圖7 濕熱證動物模型溫度使用頻次分布

圖8 濕熱證動物模型濕度范圍使用頻次分布

圖9 濕熱證模型生物因子種類分布

圖10 濕熱證模型飲食物質形態(tài)構成分布

2.3 濕熱證動物模型的分類及疾病分布

表2-4示，濕熱證動物模型中38.6 %(49/127)為病證結合模型，61.4 %(78/127)為單純中醫(yī)證候模型。證候模型的分類按頻次依次為：脾胃濕熱證、溫病濕熱證、大腸濕熱證、濕熱證、肝膽濕熱證；病證結合動物模型涉及6大類疾病，按頻次依次為消化系統疾病、傳染病、皮膚病、呼吸系統疾病、泌尿系統疾病、代謝病，以及不同類型濕熱證造模方法及優(yōu)缺點。

表2 濕熱證動物模型分類比較

表3 濕熱證病證結合動物模型的疾病分布

2.4 濕熱證動物模型評價標準

目前濕熱證臨床診斷標準主要包括《中醫(yī)臨床診療術語證候部分(修訂版)》《中藥新藥臨床研究指導原則(試行)》《中醫(yī)病證診斷療效標準》。以上3個濕熱證診斷標準均是基于濕熱證臨床癥狀及體征來評判。由于人與鼠的種屬差異性，動物模型僅模擬部分臨床的癥狀、體征。目前濕熱證動物模型從癥狀、體征、微觀指標三個維度進行評價(見表5)，其中癥狀是最廣泛使用的評價手段，體征檢測相對癥狀觀察費時費力，故較少應用；而臨床和動物模型上證據一致的微觀指標，其應用尚未得到公認，仍需進一步探索。

表4 常見疾病的濕熱證動物模型造模方法及優(yōu)缺點

表5 濕熱證動物模型評價維度及指征

3 討論

濕熱證動物模型文獻發(fā)表數量自2000年逐步增加，2005～2014年迅猛發(fā)展，表明國家對中醫(yī)藥事業(yè)的大力支持以及學術界對濕熱證候的重視，推動濕熱證動物模型研究不斷向前發(fā)展。雖然濕熱證領域越來越受到重視，但濕熱證動物模型尚未取得重大突破，其發(fā)展陷入瓶頸，因此近5年濕熱證動物模型研究漸漸陷入頹勢。濕熱證研究機構涉及不同地域，且傳統中醫(yī)藥大學和綜合性大學均對濕熱證開展了研究，表明濕熱證候不僅是中醫(yī)藥界關注的領域，同時也是現代醫(yī)學重視的方向。居于南方的學術機構對濕熱證動物模型研究更多，可能與嶺南地區(qū)特殊的地理環(huán)境、氣候條件及濕熱證高發(fā)有關。

SD大鼠是濕熱證動物模型最廣泛采用的動物，可能與大鼠血樣較易采集，表征較易觀察等因素，但大鼠是否是濕熱證最適宜的模型，還需要更多地對比研究提供證據。有研究發(fā)現，在輪狀病毒感染所致的大腸濕熱證動物模型中，BALB/c小鼠較Wistar大鼠更貼近大腸濕熱證模型[23]。比較登革熱病毒感染的4周齡BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠濕熱證模型，發(fā)現BALB/c小鼠在血小板、肝損傷、血脂方面變化更明顯[24]。不同種屬和品系的動物對同一致病因素易感性不同，不同疾病最適宜的濕熱證動物種屬還需要進一步研究。在性別的選擇上，濕熱證動物模型雄性動物總體高于雌性動物，可能與雌性發(fā)情周期會引起不良的實驗影響，且雄性動物受高脂飲食影響更為顯著有關[25]。

目前濕熱證動物模型大多使用“外濕”+“內濕”的造模方法，可同時復合“外邪”或“體質”因素，單因素化學藥物干預造模較少。高脂高糖飲食是內濕形成的重要因素，其物理狀態(tài)分為液態(tài)和固態(tài)兩種，在濕熱證的造模中以固體飼料為主，但固態(tài)飼料是否是最佳選擇尚缺乏相應的研究證據。飲食物理狀態(tài)的不同可造成喂食方式與攝取量的差異，如濕熱證模型進食量減少的前提下，液體灌服方式更能確保動物的攝食量，且研究表明液體飲食可增加食物攝入量，從而增加體內脂肪[26]。高脂高糖飲食是公認的造成肥胖、糖脂代謝紊亂的有效方法，而濕和水液代謝障礙密切相關，脂肪和糖的過量攝入對水液代謝的影響尚不完全清楚，但研究發(fā)現肥胖不僅僅是脂肪組織的過度聚積，同時也是一種低度的慢性炎癥狀態(tài)[27]。而炎癥與水液代謝障礙密切相關。在炎癥介質等多種因素作用下，毛細血管膜對液體和溶質的通透性增加，血管與間質的液體交換出現障礙，可使液體積聚導致水腫，從而產生一系列病理反應。

“外濕”是誘發(fā)濕熱證的重要條件，造模箱用于提供濕熱環(huán)境，在濕熱證動物造模中具有重要作用。其溫度集中在30 ℃～35 ℃、濕度在90 %～95 %之間，溫度32 ℃使用頻率最多，相對濕度以95 %使用頻率最多，但尚無對不同溫度、濕度的最優(yōu)設定值進行的研究。研究表明，造模持續(xù)日期越長其模型越穩(wěn)定，但其模型也僅持續(xù)4周[28]。但造模過程中濕熱環(huán)境、每日持續(xù)時長和持續(xù)日期尚無定論，最佳條件還需進一步深入探索。部分研究者用游泳或冷水浸泡作為外濕環(huán)境成功誘發(fā)濕熱證，表明濕度因素可能相對溫度更有益于濕熱證的形成。細菌、病毒、內毒素作為“外邪”在機體內通過快速炎癥效應，以促進濕熱證的形成，但對于慢性非感染性疾病、生物因子誘導的濕熱證“病理過程”與研究本意相悖。

為了更簡易快捷地造成濕熱證，部分研究者根據濕熱證特征性表征如舌苔黃膩、黃疸等為評價指標，選擇特定化學藥物進行造模。如文杰等用膽胰管推注5%牛磺膽酸鈉造急性胰腺炎大鼠模型，出現舌苔厚膩的達42.6 %[29]；皮膚黃疸是肝膽濕熱證的典型表征，曹洪欣等用異硫氰酸α-萘酯(α-naphthylisothiocyanate，ANIT)和四氯化碳(carbontetrachloride)成功模擬濕熱黃疸[30]。這類單一因素的模型復制方法雖然復制出明顯的中醫(yī)證候表征，但忽略了病因是證候形成的關鍵因素之一，其應用存在一定的爭議。

本研究還發(fā)現，病證結合模型和單純中醫(yī)證候模型造模方法多有重合，如腹瀉病濕熱證[12]、大腸濕熱證[13]和溫病濕熱證[14]均使用相同的造模方法(高脂高糖飲食+濕熱環(huán)境+大腸埃希菌)，表明動物模型模擬臨床同一證候不同亞型存在技術上的困難和瓶頸，需要臨床研究提供不同證候亞型之間特征的標志物和表征，為證候動物模型研究提供可借鑒的標準，從而促進證候動物模型的發(fā)展。濕熱證動物模型主要涉及消化系統疾病、傳染病、代謝病等領域，這與濕熱證臨床研究結果一致[5]，但2型糖尿病濕熱證動物模型尚無文獻報道。實際上，越來越多的臨床研究表明，濕熱證是2型糖尿病的主要證候之一，其病證結合動物模型研究也將成為未來研究的重點和難點[7]。

臨床濕熱證診斷依據傳統“望聞問切”四診信息。由于動物與人在種屬上的固有差異，且在動物身上只能用望診、聞診，因此尋找客觀、特異性的癥狀和指標成為判斷濕熱證動物模型造模成功與否的關鍵。目前，舌紅、苔黃膩是公認的濕熱證診斷“金指標”。在《中醫(yī)臨床診療術語證候部分(修訂版)》《中藥新藥臨床研究指導原則(試行)》《中醫(yī)病證診斷療效標準》中，濕熱證診斷標準的共性診斷條目為舌紅、苔黃膩，可見舌診是濕熱證的關鍵診斷指標。雖然舌診尚未普遍應用于濕熱證動物模型的診斷，但有研究者利用光學相干層析成像技術對動物舌苔進行分析，發(fā)現動物舌苔厚度分布與正常人體的舌苔分布相吻合；且發(fā)現脾胃濕熱證大鼠舌苔厚度明顯升高，而舌體含液量則明顯降低，與濕熱證明顯相關[31]，表明舌診有潛力成為濕熱證動物模型診斷指標。研究發(fā)現，某些炎癥[32]、免疫反應[33]、氧化應激[34]、水液代謝[35]、血液流變學[36]、神經內分泌[37]的指標與濕熱證密切相關，但此類指標缺乏特異性，其應用尚存在爭議。為更客觀的評價濕熱證動物模型，亟需發(fā)掘濕熱證的特異性指標協助診斷。

近年來，濕熱證獲得越來越多學者的關注，建立公認、成熟的濕熱證動物模型是重點也是難點。濕熱證動物模型干預因素眾多，造模方法多樣，各有其優(yōu)缺點，不斷細化各實驗變量，進一步探索更符合臨床實際的濕熱證動物模型尤為重要，其中建立客觀、合理的濕熱證模型評價體系是濕熱證動物模型研究的關鍵環(huán)節(jié)。隨著現代科技水平的不斷發(fā)展，在大數據和多組學技術的協同作用下，將有望發(fā)掘出濕熱證的特異性、客觀化指標體系，進一步促進濕熱證動物模型的發(fā)展。