顛茄種子質量檢驗方法研究

范 為， 熊維政， 董誠明， 李 磊， 郭 立， 馮言顏

(1.河南中醫藥大學， 鄭州 450046； 2.河南羚銳制藥股份有限公司， 河南 信陽 465550)

顛茄(AtropabelladonnaL.)又稱“野山茄”“顛茄草”，是茄科(Solanaceae)顛茄屬(AtropaL.)多年生草本，原產于歐洲地中海地區和小亞細亞，20世紀30年代引入我國[1]。顛茄味微苦、辛，有毒，主要有效成分為托烷類生物堿，具有鎮痛、抗炎、活血等藥理活性[2-3]。顛茄是我國藥典規定的唯一托品烷類生物堿藥源植物，顛茄草飲片在中醫臨床處方上使用較少,現常將顛茄草制備成流浸膏、浸膏、酊劑、片劑等成藥制劑供臨床使用[4]。

現階段顛茄為種子繁殖，一年生栽培，全草采收。中藥材種子質量關乎最終的產量與質量，顛茄草因其產地分布零散，標準化種植基地仍在建設中，缺乏基礎性的生藥研究，目前對顛茄的研究多集中在化學成分、毛狀根等方面，國內至今未見關于顛茄種子質量的報道。本研究參考農作物種子檢驗規程[5]，對顛茄種子檢驗方法進行研究，以期為顛茄種子標準的制定提供依據，為顛茄草規范化種植基地的建設積累科研資料。

1 材料和方法

顛茄種子于2019年6月28日采自河南省新縣滸灣鄉河南羚銳制藥中藥材種植基地，經河南中醫藥大學董誠明教授鑒定為顛茄(AtropabelladonnaL.)的成熟干燥種子。

1.1 種子真實性鑒定[6]

隨機取顛茄種子100粒，置于體式顯微鏡下觀察種子表面性狀特征[7]，并記錄種子長、寬、厚的數值(mm)，重復3次。

1.2 扦 樣

按照凈度分析試驗不能少于2 500粒種子、送檢樣品的重量超過凈度分析量10倍的原則，用四分法分取樣品進行試驗[8]。

1.3 凈度分析

考慮顛茄種子混雜的細小塵屑影響凈度分析的準確性與可操作性，先將待分析的種子過20目篩，再進行凈度分析。用鑷子將雜質揀出并分別稱重，重復3次，計算凈度。

1.4 千粒重測定

千粒重量測定方法如下： 1) 百粒法：每組100粒種子，重復8次； 2) 五百粒法：每組500粒種子，重復6次； 3) 千粒法：每組1000粒種子，重復3次。每組種子分別稱重(g)，結果精確到0.001 g，計算三種方法稱量結果的平均值、標準差和變異系數。

1.5 水分測定

顛茄種子水分測定采用整粒低恒溫烘干和整粒高恒溫烘干2種方法進行試驗。隨機取2份凈種子，每份約2 g，分別于(105±2)℃和(130±2)℃條件下烘干，重復3次。種子含水量計算公式如下：

種子含水量(%)=[(M2-M3)/(M2-M1)]×100%;

式中：M1為稱量瓶質量，M2為稱量瓶及樣品烘干前質量，M3為稱量瓶及樣品烘干后質量。

1.6 生活力測定

采用TTC染色法，用pH 6.5～7.0的磷酸緩沖溶液將TTC配制成0.1%、0.3%、0.5%的溶液，避光保存。前期預試驗發現顛茄種皮透水性較弱，整粒種子直接染色效果差，故將種子浸于常溫蒸餾水中過夜[9]，用刀片將種子縱切，暴露胚或剝取胚，備留染色用。選取TTC濃度(A)、染色時間(B)、染色溫度(C)為考察因素，每個因素選取三個水平，避光染色，以生活力為評價指標，用L9(33)安排試驗，因素水平見表1[10]。每處理300粒種子，3次重復，每重復100粒種子。

表1 顛茄種子TTC染色法因素水平表

1.7 發芽試驗

1.7.1發芽床的影響試驗

設置紙上(設1～3層)、紙間、沙上、沙間四種發芽床，30 ℃恒溫黑暗培養箱中發芽。各處理種子的試驗量為100粒，3次重復。

1.7.2溫度的影響試驗

以2層濾紙做發芽床，于5、10、15、20、25、30、35 ℃恒溫黑暗，15 ℃/25 ℃、20 ℃/30 ℃變溫黑暗條件下進行發芽試驗，各處理種子的試驗量為100粒，3次重復。

1.7.3光照的影響試驗

以2層濾紙做發芽床，于12 h光照/12 h黑暗和全黑暗，30 ℃恒溫條件下進行發芽試驗。各處理種子的試驗量為100粒，3次重復。

2 結果與分析

2.1 顛茄種子性狀

顛茄種子三角狀腎形、橢圓形或卵形，長1.6～2.3 mm，寬1.0～1.8 mm,厚0.4～1.0 mm，灰黃色或深褐色，無光澤。表面具微凸的細網紋。背面寬圓，腹面近平截，種臍位于腹面微凸處，具絨毛。胚乳豐富，胚呈環狀彎曲，乳白色(見圖1)。

圖1 顛茄種子特征圖

2.2 扦 樣

顛茄種子凈度分析試樣量大于3 g，送檢樣品量不少于30 g。

2.3 凈度分析

顛茄種子凈度分析結果見表2。3次重復的結果誤差在5%以內，表明此分析方法準確可行。

表2 顛茄種子凈度分析結果

2.4 千粒重測定結果

顛茄種子千粒重測定結果見表3。3種方法測定值的變異系數均小于4.0%，3種方法均可行。百粒法所需種子量少，因此顛茄種子千粒重量測定采用百粒法。

表3 顛茄種子千粒重測定結果

2.5 水分測定

顛茄種子水分測定結果見表4。整粒低恒溫(105±2)℃烘干4 h后水分含量無顯著性變化，整粒高恒溫(130±2)℃烘干2 h后水分含量無顯著性變化，且該方法測得的種子含水量較高，宜采用整粒高恒溫(130±2)℃烘干2 h測定顛茄種子含水量。

表4 顛茄種子水分測定結果

2.6 生活力測定

顛茄種子生活力測定試驗結果見表5，由試驗極差R得出影響因素大小為TTC濃度>染色溫度>染色時間。根據綜合評分，按單指標方法做直觀分析，得出TTC法測定顛茄種子生活力的最佳條件為A2B3C2，即縱切或剝取種子胚，在0.3%TTC溶液中30 ℃恒溫黑暗條件下染色3 h(見圖2)。

注：A～D為有生命活力的胚；E～H為無生命活力的胚。

表5 不同TTC濃度、染色時間、染色溫度對顛茄種子生活力的影響

2.7 發芽率測定

2.7.1發芽床選擇

不同發芽床對顛茄種子萌發的影響見表6，紙上、紙間、沙上、沙間發芽床對種子發芽率影響不顯著(p>0.05)，紙上、沙上、沙間處理的發芽勢顯著高于紙間處理的發芽勢(p<0.05)。出于經濟和便捷考慮，把紙上作為顛茄種子的發芽床。

表6 不同發芽床對顛茄種子發芽率的影響

不同紙張層數(1～3層)對顛茄種子萌發的影響見表7，紙張層數對顛茄種子發芽率和發芽勢影響不顯著(p>0.05)，綜合操作便捷性和保濕性能考慮，選用2層作為顛茄發芽的紙張層數。

表7 紙張層數對顛茄種子萌發的影響

2.7.2發芽溫度確定

不同溫度對顛茄種子萌發的影響見圖3，種子在10、15、20、25、30、35 ℃恒溫及15 ℃/25 ℃、20 ℃/30 ℃變溫條件下終發芽率分別為0、24.00%、42.33%、63.67%、88.00%、47.00%、51.67%、86.00%發芽勢分別為0、4.33%、35.67%、45.67%、57.67%、47.00%、29.67%、83.67%。種子在30 ℃與20 ℃/30 ℃變溫條件下的終發芽率無顯著性差異，且顯著高于其他處理(p<0.05)。綜合以上結果，顛茄種子發芽溫度以30 ℃恒溫和20 ℃/30 ℃變溫條件最好，30 ℃恒溫條件便于操作，建議在實際生產中應用。

圖3 不同溫度培養條件下顛茄種子發芽率的變化

2.7.3發芽光照選擇

不同光照條件對顛茄種子萌發的影響見表8，顛茄種子在全黑暗條件下的發芽率和發芽勢顯著高于12 h光照/12 h黑暗的處理(p<0.05)，因此顛茄發芽宜在全黑暗條件下進行。

表8 光照條件對顛茄種子萌發的影響

2.7.4顛茄種子發芽首次和末次計數時間

在確定的最優條件發芽試驗中，顛茄種子發芽起始時間為第5～6天 (圖4)，發芽終止時間為第14天。因此顛茄種子發芽試驗首末次計數時間為5～14 d。

圖4 顛茄種子發芽形態

3 結論與討論

本研究從凈度、千粒重、含水量、生命活力、發芽率試驗對顛茄種子質量進行了初步研究，適用于顛茄種子質量檢驗。目前，顛茄種子須由人工采收。在預實驗中發現，少數種子籽粒瘦弱且種皮顏色較淺，這類種子發芽率極低，或者發芽完成的時間超過正常值，考慮這類種子成熟度不夠，種皮顏色、種子大小與種子質量的聯系需進一步研究[11]，顛茄植株的花序形態為二歧聚傘花序，進入花期后頂花序上的果實便開始成熟且生長時間長，成熟度高于植株頂端的果實，關于種子的采種時間與成熟度的劃分方法的研究還有待進一步開展。

在進行水分測定預實驗時，由于顛茄種子顆粒較小且胚乳中脂質成分較多，粉碎后的種子互相發生粘黏，使試驗不可控因素增多，權衡試驗可操作性與結果準確性，最終選擇整粒法進行水分測定試驗；此外，在顛茄種子生活力試驗中，整粒種子直接染色效果較差，剝取種子胚具有不可操作性，將種子縱切進行染色效果較好；在發芽試驗中考察了不同溫度處理，結果表明，30 ℃恒溫和20 ℃/30 ℃變溫處理的種子發芽率最高，可達到85%以上。顛茄種子發芽完成的時間較長，而顛茄又存在最佳采收期的問題，建議實際育苗時可使用一些商品育苗基質[12]，以提高種苗質量，同時使其出苗一致，進而確保藥材高產和質量穩定。此外，顛茄種子種皮透水性弱且較硬實，本實驗發芽前采用50 ℃水浸種，攪拌冷卻后再浸泡12 h作為發芽前的種子處理，種子處理方法還有待進一步考察。

2020年版《中國藥典》規定顛茄草的采收期為“開花至結果期”，全草采收，本課題組通過產地調研發現，在實際生產中顛茄常經醫藥公司承包給農戶種植，出于種植面積有限和留種的考慮，農戶常將種子單獨出售，破壞了全草的完整性，很難保證藥材質量穩定，應加快推進顛茄草留種基地的建設。