3M MDS沙門氏菌分子檢測試劑盒的評價

林 杰，徐 珊，鄭 晶，柯 璐，陳 彬，張溫玲，曾維楊

(福州海關技術中心//福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建 福州 350003)

沙門氏菌是一群形態、培養、生化反應和抗原構造相類似的革蘭氏陰性桿菌，迄今已發現的沙門氏菌有2 000多個種(或型)，我國發現200多種菌型。沙門氏菌是食品中常見的主要腸道桿菌，能夠引起急性胃腸炎、傷寒、食源性動物敗血癥[1-3]。沙門氏菌感染人的途徑大多直接或間接地與動物性食品有關，沙門氏菌很容易在自然環境及動物體內存活和增殖，因此準確快速地檢測食品中的沙門氏菌，對于保護人畜健康有著十分重要的意義[4-5]。由于商品化試劑盒方法具有簡便快速、靈敏度高、特異性強的特點，可以節約大量培養基配制和操作時間，因此近年來得到廣泛應用，相關產品也有不少[6-10]。3M MDS分子檢測試劑盒采用環介導等溫擴增技術來快速擴增，結合使用生物發光特性來檢測擴增，實時報告陽性結果，陰性結果將在60 min內得到。該方法具有高特異性和高敏感性的特點，并且檢測快速、易于操作。為了更加科學規范的使用試劑盒，根據SN/T 3256—2012《食品微生物檢驗方法確認技術規范》[11]和SN/T 2775—2011《商品化食品檢測試劑盒評價方法》[12]的要求，對3M MDS分子檢測試劑盒進行評價試驗，評估其在食品中沙門氏菌檢測的準確性和適用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：腸炎沙門氏菌，ATCC13076；大腸埃希氏菌，ATCC25922，均購自上海漢尼生物技術有限公司。

試劑：緩沖蛋白胨水，3M MDS沙門氏菌分子檢測試劑盒，亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液，沙門氏菌顯色板，營養瓊脂平板。

1.2 儀器與設備

KD-TBC-300M電子天平，福建科迪技術有限公司；Stomacher3500拍擊式均質器，英國SEWARD；恒溫培養箱，德國BINDER；3M分子檢測儀器，美國3M公司；VITEKⅡ微生物鑒定儀，法國梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1標準菌株及菌懸液的制備

將標準菌株腸炎沙門氏菌(ATCC13076)復活后，接種于營養瓊脂，36℃培養 18 h 備用。

1.3.2兩種方法對比靈敏度、特異性和準確度

根據SN/T 3256—2012《食品微生物檢驗方法確認技術規范》和SN/T 2775—2011《商品化食品檢測試劑盒評價方法》的要求，選擇5類15種樣品進行試驗。每種食品基體需要有3個樣品(標準的測試組分為25 g)，其中一個未污染、一個樣品的污染水平為1～9 CFU/25 g、一個樣品的污染水平為10～99 CFU/25 g。對于低和高的污染水平，分別進行16次平行測試；未接種的樣品進行5平行測試。添加菌為腸炎沙門氏菌(ATCC13076)。每種樣品同時按照3M MDS分子檢測試劑盒方法和GB 4789.4—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌測定》[13]進行檢測。結果見表1。靈敏度、特異性和準確度統計分析見表2。

1.3.3試劑盒耐變性

耐變性是指對同一樣品用一個分析方法，在各種正常檢測條件下進行分析，保證該分析方法的可行性。耐變性評價由以下步驟組成：確定可能影響檢測結果的因素、對每一種因素稍作改變、采用合適的方法進行耐變性檢驗。確定需要評價的變量3個：裂解時間(13 min,17 min)和裂解體積(18 μl,22 μl),反應體積(18 μl,22 μl),每個變量取兩個不同的水平。采用純培養的1株目標菌(腸炎沙門氏菌，ATCC13076)與1株非目標菌(大腸埃希氏菌，ATCC25922)進行耐變性實驗。目標菌的濃度在1～9 CFU/25 g的水平，非目標菌濃度在10～99 CFU/25 g的水平。目標菌和非目標菌均采用檢測方法所要求的培養基，采用試劑盒方法進行分析。結果見表3。

1.3.4試劑盒批間變異

為了驗證試劑盒的穩定性，取3個不同批號試劑盒進行批間變異實驗，采用純培養的1株目標菌(腸炎沙門氏菌，ATCC13076)與1株非目標菌(大腸埃希氏菌，ATCC25922)進行實驗。目標菌的濃度在1～9 CFU/25 g的水平，非目標菌濃度在10～99 CFU/25 g的水平。結果見表4。

1.3.5試劑盒包容性和排他性

包容性是指確定某一檢測方法從眾多菌中檢測到目標菌的能力。排他性是指某一檢測方法對可能引起交叉反應的相關非目標菌株的抗干擾能力。包容性：選擇100株沙門氏菌的純化菌株，用3M測試方法進行測試。排他性：選擇30株非沙門氏菌的純化菌株，用3M測試方法進行測試。

1.3.6實驗室間協同試驗

選擇牛奶樣品，添加腸炎沙門氏菌(ATCC13076)，制備未接種(L0)、低(L1)、高(L2)三個接種水平樣品，每一水平8個平行樣品。同時用3M測試方法和參考方法進行測試，7家實驗室進行協同實驗。檢測結果見表5，數據分析見表6。

2 結果和分析

2.1 靈敏度、特異性和準確度

15個食品類型的試驗結果見表1。

表1 15個食品類型的試驗結果(+/-)

試驗結果統計分析見表2。

表2 試驗結果統計分析

式中，FP為假陽性的測試數；N為未接種樣品L0的總測試數。

式中，TP為陽性的測試數；N為低濃度(L1)和高濃度(L2)樣品的總測試數。

式中，PA為兩種方法相同的陽性測試數；NA為兩種方法相同的陰性測試數；N為所有樣品的總測試數。

該試劑盒用作檢測沙門氏菌時，在5個食品種類，15個食品類型的樣品的檢測結果表明，該試劑盒相對靈敏度高、假陰性率低，相對特異性好假陽性率低，相對準確度高。兩種方法標準偏差S為0，說明兩種方法在統計學上無顯著性差異。

2.2 試劑盒耐變性

耐變性實驗結果見表3。

表3 耐變性實驗結果(+/-)

目標菌在3變量10平行檢測均檢出，非目標菌在3變量10平行檢測均未檢出。檢測結果表明，其它變量無顯著性差異。

2.3 試劑盒批間變異

批間差異實驗結果見表4。

表4 批間差異實驗結果(+/-)

目標菌腸炎沙門氏菌在3批次10平行檢測均檢出，非目標菌大腸埃希氏菌在3批次10平行檢測均未檢出。檢測結果表明，該試劑盒的批間變異無顯著性差異。

2.4 試劑盒包容性和排他性

選擇經確認的100株沙門氏菌標準菌株以及實驗室自行分離的沙門氏菌菌株，用3M試劑盒檢測，結果均為陽性，表明該試劑盒在包容性上表現良好。

選擇經確認的30株非沙門氏菌的標準菌株，用3M試劑盒進行測試，結果均為陰性，表明該試劑盒在排他性上表現良好。

2.5 試劑盒協同試驗

協同實驗結果及結果統計分析見表5、表6。

表5 協同實驗結果(+/-)

表6 協同實驗結果統計分析

7家實驗室對三個接種水平樣品的測試結果分析表明，試劑盒方法和參考方法檢測結果無差異，試劑盒方法穩定可靠。

3 結論

通過5大類15種食品兩種檢測方法的比對試驗，靈敏度、特異性和準確度試驗結果，以及7家實驗室協同試驗結果分析均說明3M MDS沙門氏菌分子檢測試劑盒和國家標準GB 4789.4—2016在食品檢測上無顯著性差異。耐變性結果表明試劑盒在檢測的裂解時間和裂解體積及反應體積范圍內對檢測結果沒有影響；批間變異結果表明不同批號試劑盒的檢測結果無顯著差異，說明試劑盒穩定性良好。包容性和排他性試驗均未出現假陰性和假陽性結果。綜上所述，3M MDS沙門氏菌分子檢測試劑盒檢測結果準確，產品性能穩定，特異性強，相對GB 4789.4—2016檢測時間可縮短48 h，能滿足食品中沙門氏菌的檢測要求。