美拉德反應(yīng)制備美味牛肝菌風(fēng)味基料的工藝研究

高然，李艷華，孫欣，田野，郭磊

（西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650224）

美拉德反應(yīng)（Maillard reaction）是羰基與氨基縮合生成類黑色素的反應(yīng)[1]，美拉德反應(yīng)能夠給食物帶來誘人的色澤、濃郁的芳香和醇厚的滋味，受到食品行業(yè)的廣泛關(guān)注，常用于食品加工、酒業(yè)釀造、中藥炮制、煙草研制以及飼料制備等過程[2-3]。美拉德反應(yīng)通過醛、酮及還原糖的羰基與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等含氮化合物的游離氨基發(fā)生反應(yīng)[4]，可以改善食品的色、香、味、質(zhì)，在食品加工特別是調(diào)味料的資源開發(fā)中有著十分重要的意義。

美味牛肝菌（Boletus edulis）屬真菌界（Fungi），擔(dān)子菌門（Basidiomycota），蘑菇亞門（Agaricomycotina），蘑菇綱（Agaricomycetes），牛肝菌目（Boletales），牛肝菌科（Boletineae），牛肝菌屬（Boletus）[5]。美味牛肝菌肉厚細(xì)軟，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，長期食用可以增強機體免疫能力，具有抗腫瘤、抗突變、降血脂、抗病毒等作用[6]。美味牛肝菌的蛋白水解物中富含肽類和氨基酸，是制備熱反應(yīng)香精的風(fēng)味前體物質(zhì)，利用復(fù)合酶解技術(shù)對美味牛肝菌蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，添加外源氨基酸和還原糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)，制備一款具有菌菇風(fēng)味、且能提升食品整體鮮味和醇厚味的高檔調(diào)味核心基料，有著廣闊的市場發(fā)展前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

美味牛肝菌：云南易門縣康源菌業(yè)有限公司；風(fēng)味蛋白酶（2×104U/g）、纖維素酶（2×104U/g）、L-谷氨酸：河南萬邦實業(yè)有限公司；氫氧化鈉：成都金山化學(xué)試劑有限公司；鹽酸：昆明汕滇藥業(yè)有限公司；以上試劑均為分析純。

UV-VIS 300紫外可見分光光度計：美國Thermo Fisher公司；BAS224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HH-2數(shù)顯電子恒溫水浴鍋：金壇市丹瑞電器廠；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；YB-250A多功能粉碎機：永康市速鋒工貿(mào)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 美味牛肝菌酶解液的制備

將美味牛肝菌于60℃恒溫干燥箱中干燥24 h后粉碎，過60目篩，采用纖維素酶和風(fēng)味蛋白酶的復(fù)合酶（1∶1，質(zhì)量比），在初始 pH6、料液比 1∶36（g/mL）、溫度50℃下酶解5 h。酶解結(jié)束后迅速在90℃下滅酶，離心分離得上清液備用[7]。

1.2.2 風(fēng)味前體物質(zhì)氨基酸與還原糖的選擇

根據(jù)前期研究結(jié)果[8]，選擇葡萄糖和L-谷氨酸為底物進(jìn)行美拉德反應(yīng)。

1.2.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變指數(shù)A420nm測定

根據(jù)蔣迪等[9]的方法進(jìn)行測定，以10 mL美味牛肝菌酶解液為基準(zhǔn)，進(jìn)行美拉德反應(yīng)后溶液稀釋5倍在波長420 nm處測定吸光度，以未進(jìn)行美拉德反應(yīng)的酶解液作為對照。褐變指數(shù)A420nm越大，表明經(jīng)美拉德反應(yīng)后的褐色產(chǎn)物越多。

1.2.4 單因素試驗

固定反應(yīng)溫度90℃，葡萄糖添加量3%，L-谷氨酸添加量0.4%，初始pH4，考察不同反應(yīng)時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420nm及感官評分的影響；固定反應(yīng)時間2.0 h，葡萄糖添加量3%，L-谷氨酸添加量0.4%，初始pH4，考察不同反應(yīng)溫度（80、85、90、95、100℃）對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420nm及感官評分的影響；固定反應(yīng)時間2.0 h，反應(yīng)溫度90℃，L-谷氨酸添加量0.4%，初始pH4，考察不同葡萄糖添加量（1%、2%、3%、4%、5%）對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420nm及感官評分的影響；固定反應(yīng)時間2.0 h，反應(yīng)溫度90℃，葡萄糖添加量3%，初始pH4，考察不同L-谷氨酸添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物 A420nm及感官評分的影響；固定反應(yīng)時間2.0 h，反應(yīng)溫度90℃，葡萄糖添加量3%，L-谷氨酸添加量0.4%，考察不同初始 pH 值（2、3、4、5、6）對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物 A420nm及感官評分的影響。

1.2.5 正交試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、葡萄糖添加量、L-谷氨酸添加量及初始pH值為自變量，以美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變指數(shù)A420nm及感官評分為因變量Y，設(shè)計五因素四水平的L16（45）正交試驗，優(yōu)化美味牛肝菌酶解液美拉德反應(yīng)的最佳工藝參數(shù)，正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.6 感官評價

邀請經(jīng)過系統(tǒng)理論教學(xué)和專業(yè)實踐的業(yè)內(nèi)人員10人（男士5人，女士5人）對美味牛肝菌酶解液美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行感官評價，評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。根據(jù)表2的感官評分標(biāo)準(zhǔn)，按照色澤、香氣及滋味分別對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行評價，滿分10分，最終評分取其平均值。

表2 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Standards of sensory evaluation

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素及正交試驗均做3次平行試驗并取平均值。試驗數(shù)據(jù)采用OriginPro 2017C軟件作圖，并用Excel 2010及IBM SPSS Statistics20軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及顯著性分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 反應(yīng)時間對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420nm及感官評分的影響

反應(yīng)時間對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420nm及感官評分的影響見圖1。

圖1 反應(yīng)時間對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420 nm及感官評分的影響Fig.1 Effect of reaction time on the A420 nmand sensory score of Maillard reaction products

由圖1可知，隨著反應(yīng)時間的延長，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，感官評分在2.0 h時達(dá)到最高，為7.66。在2.0 h內(nèi)，葡萄糖和L-谷氨酸發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生了一系列吡嗪類化合物及含硫化合物等，使反應(yīng)液中的鮮味及燒烤味等風(fēng)味增加[10]，感官評分逐漸增加。反應(yīng)時間超過2.0 h后，長時間的高溫反應(yīng)會造成美拉德反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)生焦糊味[11]，造成感官評分的降低。同時，隨著反應(yīng)時間的延長，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的A420nm也呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，因此，選擇反應(yīng)時間1.0 h～2.5 h進(jìn)行后續(xù)正交試驗。

2.1.2 反應(yīng)溫度對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420nm及感官評分的影響

反應(yīng)溫度對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420nm及感官評分的影響見圖2。

由圖2可知，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評分隨著反應(yīng)溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這是因為反應(yīng)溫度低于90℃時，美拉德反應(yīng)可能不完全，產(chǎn)物色澤較淺、香氣及滋味寡淡不協(xié)調(diào)，而反應(yīng)溫度超過90℃時美拉德反應(yīng)過度，焦糊味嚴(yán)重。反應(yīng)溫度與A420nm呈正相關(guān)關(guān)系，溫度越高，美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的類黑精色素越多，顏色越深。綜合感官評分和A420nm，選擇反應(yīng)溫度85℃～100℃進(jìn)行后續(xù)正交試驗。

圖2 反應(yīng)溫度對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420 nm及感官評分的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on the A420 nmand sensory score of Maillard reaction products

2.1.3 葡萄糖添加量對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420nm及感官評分的影響

葡萄糖添加量對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420nm及感官評分的影響見圖3。

圖3 葡萄糖添加量對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420 nm及感官評分的影響Fig.3 Effect of glucose addition on the A420 nmand sensory score of Maillard reaction products

由圖3可知，葡萄糖添加量對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評分的影響略小，葡萄糖添加量為3%時，美拉德反應(yīng)后呈現(xiàn)出的美味牛肝菌特殊香氣、海鮮味及燒烤味突出，感官評分達(dá)到8.0。葡萄糖添加量超過3%時，由于焦糖化反應(yīng)過度會產(chǎn)生焦糊味，感官評分降低。同時，還原糖與氨基化合物的比例也會影響美拉德反應(yīng)過程中的化學(xué)平衡，造成反應(yīng)產(chǎn)物的A420nm先增大后減小。因此，選取葡萄糖添加量2%～5%進(jìn)行后續(xù)正交試驗。

2.1.4 L-谷氨酸添加量對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420nm及感官評分的影響

L-谷氨酸添加量對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420nm及感官評分的影響如圖4。

圖4 L-谷氨酸添加量對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420 nm及感官評分的影響Fig.4 Effect of L-glutamic acid addition on the A420 nmand sensory score of Maillard reaction products

由圖4可知，L-谷氨酸添加量由0.2%增加到0.4%時，感官評分從7.08升高到8.52，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)出的海鮮味及燒烤味越來越濃，美拉德反應(yīng)越來越強烈。但是，L-谷氨酸添加量超過0.4%時，L-谷氨酸呈現(xiàn)的鮮味愈發(fā)單調(diào)，口感不協(xié)調(diào)，造成感官評分下降。另外，L-谷氨酸添加量過多會造成美拉德反應(yīng)底物比例失調(diào)，影響美拉德反應(yīng)，從而造成A420nm變小。因此，正交試驗的L-谷氨酸添加量選擇0.2%～0.5%為宜。

2.1.5 初始pH值對美拉德反應(yīng)A420nm及感官評分的影響

初始pH值對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420nm及感官評分的影響如圖5。

圖5 初始pH值對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420 nm及感官評分的影響Fig.5 Effect of the original pH value on the A420 nmand sensory score of Maillard reaction products

由圖5可知，初始pH值為4時感官評分和A420nm都達(dá)到最佳，此時美拉德反應(yīng)產(chǎn)物既有美味牛肝菌特殊香氣，也有海鮮和燒烤風(fēng)味，且顏色呈棕黃色，口感濃郁協(xié)調(diào)，風(fēng)味最佳。pH值影響氨基酸的解離狀態(tài)，pH值過低，美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物變得不活潑，得不到大量芳香類物質(zhì)。pH值升高會加速焦糖化反應(yīng)，產(chǎn)生不良?xì)馕?，結(jié)果與朱振元等[12]研究結(jié)果一致。A420nm值隨初始pH值的增加呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，說明初始pH值對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的色澤影響較大。綜上所述，初始pH值選擇2～5進(jìn)行后續(xù)正交試驗。

2.2 正交試驗結(jié)果

正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design and results

續(xù)表3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Continue table 3 Orthogonal experimental design and results

由表3可知，對于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420nm來講，各變量影響的主次順序為A（反應(yīng)時間）＞E（初始pH值）＞B（反應(yīng)溫度）＞D（L-谷氨酸添加量）＞C（葡萄糖添加量），其中反應(yīng)時間和初始pH值是影響美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420nm的主要因素，最佳反應(yīng)條件為A2B3C3D3E2。各變量對美味牛肝菌酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物感官評分的影響順序為C（葡萄糖添加量）＞A（反應(yīng)時間）＞D（L-谷氨酸添加量）＞B（反應(yīng)溫度）＞E（初始pH值），其中葡萄糖添加量是影響感官評分的主要因素，最佳的美拉德反應(yīng)條件為A2B4C2D4E2或A2B4C2D4E4。反應(yīng)溫度對A420nm的影響程度要遠(yuǎn)大于其對感官評分的影響，故反應(yīng)溫度選擇95℃。同理，綜合考慮各因素對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物A420nm及感官評分的影響，葡萄糖添加量選擇3%，L-谷氨酸添加量選擇0.5%，即美拉德反應(yīng)的最佳工藝參數(shù)組合為A2B3C2D4E2，即反應(yīng)時間2.0 h、反應(yīng)溫度95℃、葡萄糖添加量3%，L-谷氨酸添加量0.5%，初始pH 3。

2.3 驗證試驗

采用最佳美拉德反應(yīng)條件（即反應(yīng)時間2.0 h、反應(yīng)溫度95℃、葡萄糖添加量3%，L-谷氨酸添加量0.5%，初始pH3）進(jìn)行3次平行試驗，獲得美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官評分為8.37，A420nm為0.241，優(yōu)于正交試驗的所有組合，證明優(yōu)化結(jié)果是可靠的。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物色澤均勻呈棕褐色、具有美味牛肝菌特殊風(fēng)味和濃郁的海鮮味及燒烤味，口感協(xié)調(diào)飽含鮮、甜味，無異味。

3 結(jié)論

通過外源添加葡萄糖和L-谷氨酸，以美味牛肝菌酶解液為試驗原料，以感官評分和A420nm為試驗指標(biāo)，通過美拉德反應(yīng)制備美味牛肝菌風(fēng)味基料。在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用L16（45）正交試驗優(yōu)化出美味牛肝菌酶解液美拉德反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件。反應(yīng)時間2.0 h、反應(yīng)溫度95℃、葡萄糖添加量3%，L-谷氨酸添加量0.5%及初始pH3時，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，具有美味牛肝菌特有香氣、濃郁的海鮮風(fēng)味及燒烤風(fēng)味。研究結(jié)果為開發(fā)新型天然食用菌風(fēng)味基料及美味牛肝菌資源的高值化利用提供了一定理論依據(jù)和技術(shù)支撐。