LC-ESI-MS/MS結合標準品比對鑒定野菜鼠曲草中的黃酮類化合物

石青浩，李榮，李書啟，姜子濤，*

（1.天津天獅學院食品工程學院，天津300710；2.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津300134）

鼠曲草（Gnaphalium affine）是菊科擬鼠麴草屬草本植物，別名擬鼠麹草、鼠麹草、清明菜、田艾等，是民間喜愛的時令野生蔬菜。鼠曲草全草富含黃酮、氨基酸、揮發油及礦物質等多種功能性成分，營養價值高[1-5]。此外，鼠曲草全草可入藥，現代藥理學研究發現鼠曲草具有顯著的抗菌、抗病毒、抗氧化、抑制酶活性、鎮咳和祛痰等作用[6-10]，可用于治療急性支氣管炎、慢性支氣管炎、支氣管哮喘、風濕性關節炎等疾病，有很高的藥用價值。

黃酮類化合物是野菜鼠曲草中的重要生物活性成分，Morimoto等[11]發現鼠曲草中的甲氧基黃酮具有明顯的昆蟲拒食活性，可以保護鼠曲草免受昆蟲的噬咬。田彩云[12]采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）方法建立了同時測定鼠曲草中6種黃酮類成分含量的方法。高俊斌等[13]和盧曉藝等[14]通過HPLC法發現鼠曲草因產地不同及葉莖根等部位不同其黃酮類化合物含量存在較大差異。謝建祥等[15]、李勝華[16]和白麗明等[17]均采用多種色譜技術對鼠曲草的乙醇提取物進行純化，從提取物中分別鑒定出多種黃酮成分，均發現有芹菜素和木犀草素的存在，說明不同純化方法和純化條件對成分鑒定的影響較大。Lin等[18]從鼠曲草中分離出了木犀草素和木犀草素-4’-O-葡萄糖苷，并證實其有較高的藥用價值。

本課題組前期研究了鼠曲草黃酮的微波輔助提取條件，并對提取的鼠曲草黃酮與常見的抗氧化劑維生素C進行了體外抗氧化性能的比較研究[19]。本研究采用微波法輔助提取得到鼠曲草黃酮，利用大孔樹脂進行了純化，并通過高效液相色譜電噴霧離子化串聯質譜（high performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry，LC-ESI-MS/MS）結合標準品對比法，對鼠曲草黃酮成分進行了系統分析，為鼠曲草的進一步開發利用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠曲草：安徽誠信藥家有限公司，產地安徽省，烘箱干燥后粉碎，過40目篩備用。

AB-8大孔樹脂：南開大學化工廠；木犀草苷、金絲桃苷、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、毛地黃黃酮、槲皮素標準品：上海順勃有限公司；綠原酸、3，5-二咖啡酰奎寧酸、奎寧酸標準品：成都德天生物科技有限公司；甲醇（色譜純）：德國Mallinckrodt Baker公司；甲酸（色譜純）：美國Columbus Chemical Industries公司。

1.2 主要儀器

G6410A LC-MSD QQQ液相色譜-質譜/質譜聯機：美國Agilent Technologies公司；MAS-Ⅰ型微波快速制樣系統：上海新儀微波化學科技有限公司；U-3900 UV-Vis分光光度計：日本Hitachi High-Technologies公司；LGJ-10冷凍干燥機：北京松源華興科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品液的制備

鼠曲草黃酮的提取按照文獻[19]方法，以50%的乙醇為溶劑進行微波輔助提取。得到的提取液經石油醚萃取，減壓濃縮，再經冷凍干燥得到鼠曲草黃酮粗提物粉末。取粗提物粉末0.25 g，用5 mL無水乙醇溶解，并用蒸餾水定容至250 mL，即得濃度為1.0 mg/mL上樣液。上樣液經過填充有AB-8大孔樹脂的15 cm層析柱進行純化，吸附解吸參數：吸附流速2倍柱體積/h；上樣液pH4.0；以4倍柱體積的50%乙醇作為洗脫劑；解吸流速為2 BV/h。收集洗脫液，經減壓濃縮及冷凍干燥制得純化后的鼠曲草黃酮。取適量的純化后鼠曲草黃酮粉末，用50%甲醇配制成0.05 mg/mL樣品液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，供LC-ESI-MS/MS分析用。

1.3.2 標準品溶液的制備

準確稱取標準品奎寧酸、綠原酸、3，5-二咖啡酰奎寧酸、木犀草苷、金絲桃苷、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素和毛地黃黃酮各0.0100g，用50mL50%甲醇溶解后，得到濃度為200 μg/mL的標準品儲備液。然后用50%的甲醇將儲備液稀釋成10 μg/mL的標準品溶液，將標準品溶液過0.22 μm的微孔濾膜，貯存于4℃備用。

1.3.3 LC-MS/MS分析

色譜條件：采用ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）硅膠色譜柱，柱溫為30℃。流動相為甲醇-水體系（水相中含0.1%甲酸），采用梯度洗脫的方式：0～10min，甲醇由50%勻速升高至72%，然后保持該體積分數繼續運行12 min，流動相流速為0.3 mL/min。鼠曲草黃酮樣品溶液進樣量為8 μL，黃酮標準品溶液進樣量為5 μL。

質譜條件：電噴霧ESI負離子源，霧化氣體為N2，噴霧電壓3 842 V，霧化氣流速10 L/min，霧化氣壓力35psi（1psi=6.895kPa），離子源溫度350℃，碰撞氣壓力0.15 MPa，碰撞氣體為高純 N2，m/z掃描范圍，100 amu～1 000 amu。

2 結果與分析

2.1 鼠曲草黃酮的定性分析

鼠曲草黃酮樣品和黃酮標準品的LC-ESI-MS/MS總離子流圖如圖1所示。

圖1 鼠曲草黃酮和標準品的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of flavonoids from Gnaphalium affine and standards

如圖 1 所示，鼠曲草黃酮樣品 1、2、3、4、6、7、8、9 和11號化合物與9種黃酮標準品的保留時間一致，可初步斷定樣品液中這9種成分與標準品是相同化合物。

對鼠曲草黃酮樣品液和標準品溶液中每一個準分子離子[M-H]-進行二級質譜分析，以得到具有特征信息的碎片離子，根據待測物質一級質譜的準分子離子的質荷比（m/z）、保留時間及二級質譜的主要子離子的m/z與標準品相比較，結果見表1，并參考相關的文獻[20-23]，對鼠曲草黃酮樣品液中的11種物質進行質譜鑒定。

表1 樣品和標準品中各化合物的保留時間和碎片離子Table 1 The retention time and fragment ions of each compound in sample and standards

通過對比可以進一步確定 1、2、3、4、6、7、8、9、11號化合物分別為奎寧酸、綠原酸、3，5-二咖啡酰奎寧酸、木犀草苷、金絲桃苷、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、毛地黃黃酮，其結構式見圖2。

化合物5的二級質譜見圖3。

圖 2 化合物 1、2、3、4、6、7、8、9、11 的結構式Fig.2 The structural formula of compound 1，2，3，4，6，7，8,9 and 11

圖3 化合物5的二級質譜圖Fig.3 MS2spectrum of compound 5

由圖3可見該化合物準分子離子m/z為461；子離子m/z為285，是野黃芩苷的特征峰。其準分子離子和子離子與文獻中報道的野黃芩苷標準物質的質譜碎片相同[20-21]。減少的m/z為176的殘基是由化合物5在裂解過程中脫去一分子的葡萄糖醛酸碎片產生的。結合文獻[22]判斷化合物5為野黃芩苷，其裂解過程見圖4。

圖4 野黃芩苷的裂解過程Fig.4 The fragmentation process of scutellarin

化合物10的二級質譜信息見圖5。

由圖5可見該化合物準分子離子的m/z為625；子離子m/z為301，是槲皮素的特征離子。減少的質量數為324的殘基是化合物11在裂解過程中脫去兩分子的葡萄糖的結果。結合文獻[23]，可推斷該化合物為槲皮素-3-O-槐糖苷。其裂解過程見圖6。

圖5 化合物10的二級質譜圖Fig.5 MS2spectrum of compound 10

圖6 槲皮素-3-O-槐糖苷的裂解過程Fig.6 The fragmentation process of quercetin-3-O-sophorside

在鑒定出的11種化合物中，綠原酸、3，5-二咖啡酰奎寧酸、木犀草苷、野黃芩苷、金絲桃苷、槲皮素、毛地黃黃酮在相關文獻中已有報道[8,12-16，22]。但奎寧酸、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素-3-O-槐糖苷幾種化合物是在鼠曲草中首次發現。

2.2 樣品中化合物的定量分析

利用多重反應監測模式（multiple reaction monitoring，MRM），通過對鼠曲草提取液中化合物的特征碎片離子的監測來進行定量分析，以倍數稀釋法將標準品溶液稀釋成不同濃度，然后進行質譜測定。以標準品濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線，得到每一種黃酮的標準曲線方程，分別以信噪比S/N=3時各對照品的含量作為檢出限。其中有標準品對照的9種化合物采用外標法進行定量，5號化合物和10號化合物分別以木犀草苷和毛地黃黃酮為內標物進行定量，結果見表2。

由表2可見，在一定的濃度范圍內，9種標準品的線性關系良好，相關系數在0.997 4～0.999 8之間，檢出限介于1.35 ng/mL～15.9 ng/mL，添加回收率范圍在97.2%～102.5%，可見此方法具有較高的靈敏度、精密度和準確度。

表2 鼠曲草中化合物的含量Table 2 Contents of components in Gnaphalium affine

3 結論

利用LC-ESI-MS/MS技術結合標準品對比法，對鼠曲草乙醇提取物進行了成分分析鑒定，結果顯示鼠曲草中存在11種成分，分別為奎寧酸、綠原酸、3，5-二咖啡酰奎寧酸、木犀草苷、野黃芩苷、金絲桃苷、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、槲皮素-3-O-槐糖苷和毛地黃黃酮。其中奎寧酸、綠原酸、3，5-二咖啡酰奎寧酸含量最高，為酚酸類成分。其余為黃酮類成分，含量較高的為毛地黃黃酮、紫云英苷、金絲桃苷。奎寧酸、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素-3-O-槐糖苷在該植物中為首次發現。