發酵TMR應用及其微生物種群演替規律研究進展

江迪 徐春城

（1. 河南工業大學糧油食品學院，鄭州 450001；2. 中國農業大學工學院，北京 100083）

畜牧業是我國現代農業的重要組成部分，隨著我國人民生活水平的不斷提高，人們對肉蛋奶等畜產品的需求量越來越大。2019年全年肉蛋奶產量約為1.4億t，其中牛奶產高達3 201萬t，與2018年相比增長4.1%，同比增長率創下了近5年的新高［1］。畜產品需求量的穩步增長促使我國飼料糧的需求量不斷增加，糧食的供求長期處于緊平衡狀態，其中飼料用糧占糧食消費的40%以上，超過人對糧食的消費，“人畜爭糧”問題嚴重［1-2］。因此，為了緩解飼料糧對我國糧食產業的巨大壓力，減少畜牧業對糧食的依賴，加強非常規飼料資源的開發利用對促進我國畜牧業的發展至關重要。我國非常規飼料資源豐富每年近40億t。然而這些飼料資源通常因為水分含量高、營養成分不均衡、適口性差、消化率低等問題導致其應用范圍受到限制［3］。發酵全混合日糧（total mixed ration silage，TMR）作為一種在TMR調制加工技術上發展起來的新型飼喂技術，其推廣和普及能夠有效利用非常規飼料資源，緩解飼料資源短缺制約我國畜牧業穩定發展的難題［4］。由于發酵TMR厭氧發酵過程中的環境復雜，其微生物組成也多種多樣。因此飼料中的微生物組成對飼料的發酵品質及有氧穩定性都有重要作用。本文通過綜合閱讀近些年國內外關于發酵TMR研究的文獻，對TMR發酵過程及有氧狀態下的微生物種群進行分析，初步總結了發酵TMR應用及其微生物種群多樣性的研究現狀。

1 發酵TMR技術及應用

1.1 發酵TMR的加工工藝

發酵TMR是根據家畜不同生產階段的營養需要和飼料原料的營養價值，設計科學合理的日糧配方，經過乳酸菌厭氧發酵調制而成的一種營養平衡的日糧。日本早在20世紀90年代開始發酵TMR技術的研究，通過該方法使高水分食品副產物等非常規飼料能夠長期貯藏并有效利用。發酵TMR技術融合了TMR技術與青貯技術，不僅能夠有效保全了TMR的營養成分，同時發酵產生的生物活性物質又增加了飼料的附加價值［5］。由于飼料的質量通常會直接影響奶牛的產奶量、乳品質、泌乳年限及奶牛健康，因此，需要根據奶牛生長階段的營養需求對配方進行嚴格的設計。一般來說，用于調制發酵TMR的原料主要包括以下飼料（表1）。我國每年有大量的糟渣、秸稈等農產品加工副產物產生，然而利用率都不高，不但造成資源的浪費，同時還污染環境。利用農產品加工副產物調制發酵TMR能夠充分開發利用非常規飼料資源，在一定程度上解決我國飼料糧資源的不足，緩解人畜爭糧的矛盾，保護環境。利用高水分的農產品加工副產物與其他原料混合后制備發酵TMR，不僅能夠有效保存原料中的營養成分、提高有機酸、酶、維生素等功能性成分的含量，加之TMR的發酵品質良好，而且有氧穩定性得到顯著提高，促進了發酵TMR的商品化流通［6］。

表1 發酵TMR的原料組成Table 1 Raw material composition of TMR silage

1.2 發酵TMR的生產應用

在我國，規?；鲆呀洸捎肨MR 飼喂技術。TMR 飼喂方式能夠有效避免奶牛挑食和營養失衡狀況的發生；而且能夠增強瘤胃機能，維持瘤胃pH穩定，降低奶牛發病率。發酵TMR作為一種在TMR調制加工技術上發展起來的新型飼喂技術，不僅能夠提高飼料適口性，同時能夠進一步提高飼料價值，保證奶牛機體健康，提高奶制品品質。研究發現，奶牛飼喂發酵TMR后，干物質采食量（DMI）相比于對照組有了顯著的提升；同時，4%的標準乳、乳蛋白和乳糖均提高了10%以上，這些結果表明發酵TMR 對營養物質在反芻動物消化吸收的過程中均具有較好促進效果［7］。以咖啡渣、蘑菇渣、桃渣等農產品加工副產物替代部分精料、干草等常規原料調制TMR，經過發酵后，其乳酸含量顯著提高、pH和氨態氮含量顯著降低，顯著改善了TMR的發酵品質；提高了發酵TMR的適口性、增加了家畜的干物質采食量；且不影響發酵TMR的營養物質消化率及可消化養分總量和消化能；對家畜的血液指標、瘤胃發酵性狀無不良影響，同時，像綠茶飲料渣等還能提高家畜的免疫性能［8-11］?？梢?，使用高水分副產物代替部分原料制備發酵TMR，不僅能夠得到品質較好的發酵飼料，而且能夠降低生產成本，增加經濟效益。一些營養成分較少，適口性差的作物秸稈單獨作為飼料使用時，其能量和消化率都比較低，然而當使用這類原料與副產物共同調制TMR發酵后，能夠有效保持其營養成分，提高飼喂價值［12-14］。而且，與某一原料單獨青貯相比，將其與其他原料混合調制發酵TMR后無論適口性還是貯藏性都得到了較大的提高［15］。苜蓿是奶牛等草食動物的重要優質飼草，但由于水分含量高，可溶性碳水化合物含量低，緩沖能較高，青貯過程中極易發生丁酸發酵，導致飼草品質下降。而將新鮮苜蓿與玉米粉、豆漿渣、豆粕、預混料等混合調制發酵TMR后，有效解決了苜蓿難以獲得優質青貯的技術瓶頸［16］。此外，TMR暴露在空氣中48 h內即發生好氧變質，而發酵TMR暴露在空氣中7 d內無顯著變化，表現出相當好的有氧穩定性；且隨著發酵時間的延長，有氧穩定性顯著增強［17-18］。

2 發酵TMR好氧變質及其微生物影響因素

2.1 發酵TMR好氧變質

TMR厭氧發酵過程是一個微生物主導的復雜生物化學過程。TMR經過厭氧發酵后，以乳酸菌為主的有益菌，將飼料中的可溶性糖轉化為以乳酸為主的有機酸，迅速降低pH，抑制其他好氧微生物對飼料營養成分的降解作用，從而使飼料得到很好的保存。當發酵TMR開封后暴露在空氣中，好氧微生物在有氧狀態下快速增殖，飼料中的發酵酸和其他底物會被酵母、好氧細菌及霉菌利用，導致飼料發熱、pH升高、營養物質損失而發生變質［19］。發生變質的飼料干物質損失嚴重，其營養價值會隨著發酵產物的消耗而降低［20-21］。同時，由于有害微生物的孢子以及代謝過程中毒素的積累［22-25］，奶牛的健康和牛奶的品質也會受到不良影響，進而影響新鮮牛奶和奶制品的安全［5，26-28］。

2.2 好氧變質過程中的微生物影響因素

發酵TMR的好氧變質一般經歷3個階段［27］，當氧氣進入到飼料后，酵母首先利用發酵過程中產生的有機酸和殘存的可溶性糖大量繁殖，快速提高飼料的溫度和pH，為其他微生物的生長提供有利環境［24］；隨著pH的升高，好氧細菌開始增殖，進一步消耗飼料中的營養成分，升高飼料溫度；最后，霉菌在表面大量生長，飼料完全變質［19］。發酵TMR發生好氧變質的過程中一般會出現兩個溫度高峰［29］，第一個溫度高峰與酵母菌或者好氧乙酸菌的生長增殖有關，第二個溫度高峰則反映了霉菌的生長［27］。Wang等［15］在對全株玉米發酵TMR好氧變質過程中的溫度監測中發現，整個過程中共檢測到了兩個溫度高峰，第一個溫度高峰與最大酵母數量一致，且在有氧狀態下檢出了數量較高的好氧細菌，表明需氧細菌在后期降解中的作用。發酵TMR在有氧變質的過程中，乳酸等發酵酸被迅速代謝，飼料pH快速升高，從而引起梭狀芽胞桿菌的增殖，導致蛋白質和碳水化合物的大量損失。梭狀芽胞桿菌（Clostridium）一般是嚴格厭氧或者微需氧的芽胞桿菌，當好氧細菌利用乳酸產生酸性終產物較少時，飼料的pH顯著增加，一些兼性厭氧微生物進一步消耗氧氣和發酵終產物，在飼料局部形成一個厭氧高pH的小環境，為梭狀芽胞桿菌的生長提供有利條件，使其在好氧變質過程中數量增加，加速好氧變質發生［30］。而霉菌的大量出現意味著飼料中的乳酸含量較低，pH較高，此時飼料發生變質，失去飼喂價值［31］。其中，酵母被認為是好氧變質過程中最重要的微生物［24］。由于酵母喜在糖分高的偏酸環境中生長，因此雖然在厭氧發酵過程其生長會受到抑制，一旦飼料開封后，充足的底物和適宜的環境使酵母首先快速增值，提高飼料pH，為其他好氧微生物的生長提供有利環境。因此，在發酵過程中存活下來的酵母菌被認為是引起飼料好氧變質的主要微生物［24］。Beck等［32］認為酵母是導致青貯飼料發生好氧變質的主要微生物因素，當青貯飼料中的酵母數量高于105CFU/g FM時，青貯飼料更容易發生好氧變質［33］。許多研究表明，開封時酵母菌的數量是影響青貯飼料有氧穩定性的重要因素，且隨著酵母菌數量的減少，有氧穩定性增強［28，34-35］。然而Hu等［10］對發酵TMR有氧穩定性的研究發現，以苜蓿為主要原料調制的TMR經過56 d發酵后，雖然酵母菌的數量達到104CFU/g FM以上，但發酵TMR在6 d內并未發生好氧變質。因此，可以推測開封時酵母的種類比數量對有氧穩定性的影響更大。一般來說，在發酵過程及有氧狀態下被檢出的酵母種類有很多（表2）。與好氧變質有關的酵母按照其生理特征可以分為兩組，第一組是具有較高糖發酵能力的酵母，如Saccharomyces cerevisiae和Torulopsis spp.；第二組是具有高有機酸親和力的酵母，如Candida、Issatchenkia、Pichia、Hansenula和Endomycopsis［36］。其中，Pichia和Candida由于其高乳酸同化能力和高葡萄糖親和能力而在好氧變質過程中檢出率較高［24］。這類酵母往往是影響飼料好氧變質的關鍵因素。

表2 發酵過程及有氧狀態下的主要酵母Table 2 Main yeasts during ensiling and aerobic exposure

3 發酵TMR中的微生物種群多樣性

3.1 TMR發酵過程微生物種群的動態變化

發酵TMR中的微生物組成對飼料的發酵品質及有氧穩定性均具有重要的影響。針對發酵TMR中微生物種群多樣性的研究一直都是研究的熱點。對不同季節不同地域發酵TMR中的微生物組成進行分析發現，大部分發酵TMR中，芽胞桿菌和好氧細菌的數量在發酵過程中略有降低；酵母隨著發酵時間的延長，其生長逐步受到抑制；7 d后霉菌數量降至檢出限以下［37］。乳酸菌是TMR發酵過程中的優勢菌，在厭氧發酵過程中的種類較多（表3）。其中，在厭氧發酵前期的乳酸菌主要為Lactobacillus casei、Lactobacillus brevis、Tetragenococcus halpphilus、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus plantarum、Pediococcus pentosaceus、Weissella paramesenteroides和Pediococcus acidilactici，而 到 了 發 酵 后 期，Lactobacillus代替Lactococcus成為發酵TMR中的優勢乳酸菌［10，38］。TMR發酵過程中微生物種群常常與營養成分的降解密切相關。半纖維素的降解通常發生在厭氧發酵早期，Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis、Bacillus pumilus和Paenibacillus xylanexedens是 降 解 半 纖維素的主要微生物；B. amyloliquefaciens、Bacillus cereus、B. licheniformis、B. subtilis、Bacillus flexus和P.xylanexedens在發酵前期與淀粉的降解密切相關，而Enterococcus faecium是發酵后期降解淀粉的主要微生物［39］；降解蛋白的細菌主要屬于Curtobacterium和Paenibacillus，其中Curtobacterium flaccumfaciens、Paenibacillus amylolyticus、Paenibacillus borealis、P.xylanexedens和Paenibacillus turicensis為 發 酵TMR中微生物蛋白酶的主要來源；到了發酵后期，E.faecium成為發酵TMR中降解蛋白的主要細菌［40］。發酵TMR中酵母隨著發酵時間的延長其生長逐漸受到抑制，而開封后檢出的酵母通常被認為是導致好氧變質的主要微生物。Pichia kudriavzevii、Kazachstania exigua、Kluyveromyces marxianus和Candida milleri常常在發酵TMR中被檢出，抑制K.marxianus和P. kudriavzevii的生長能夠在一定程度上改善發酵TMR的有氧穩定性［38，41］。

表3 厭氧發酵過程的常見乳酸菌Table 3 Main lactic acid bacteria during ensiling

近年來，隨著分子生物學技術的飛速發展，高通量測序技術（high-throughput sequencing）被廣泛用于發酵TMR微生物種群多樣性的研究，使得我們對發酵過程的微生物種群有了進一步了解。Pediococcus、Lactobacillus等乳酸菌屬的相對豐度通常在發酵過程中顯著增加，抑制了Erwinia、Pseudomonas等有害細菌相對豐度的增長；隨著發酵時間的延長，Cryotococcus、Pseudozyma等真菌菌屬的相對豐度逐漸降低，真菌的生長逐漸受到抑制；許多發酵TMR開封時酵母和霉菌的數量處于檢出限以下，而通過高通量測序技術發現，Pichia、Candida、Aspergillus和Phanerochaete均能夠在開封時被檢出，其相對豐度隨著發酵時間的延長顯著增加［16，18］。

3.2 發酵TMR有氧狀態下的微生物種群多樣性

開封后，發酵TMR中的無氧環境由于氧氣的進入發生變化，飼料中的微生物組成隨之改變。發酵TMR在有氧狀態下的細菌種群沒有顯著變化，Lactobacillus、Pediococcus和Erwinia無論在原料、發酵過程還是有氧狀態下均能夠被檢出［16，42］。Pichia、Cryptococcus和Candida是有氧狀態下的主要酵母，其中Pichia與發酵TMR的好氧變質密切相關，P.kudriavzevii和Pichia manshurica均被認為是導致發酵TMR好氧變質的主要酵母，抑制Candida humilis在一定程度上夠提高發酵TMR的有氧穩定性；而在一些長期發酵的TMR中，Zygosaccharomyces bailii被認為是引發好氧變質的主要酵母［17-18，41，43］。霉菌一般出現在有氧狀態后期，Cladosporium、Alternaria、Aspergillus和Monascus均是有氧狀態下常見的霉菌屬；當發酵TMR好氧變質后，Monascus的相對豐度能夠達到80%以上，為發酵TMR中的主要真菌［16，18，44］。

4 總結與展望

發酵TMR技術的普及和推廣對于提高非常規飼料資源的利用效率，解決飼料資源短缺問題具有重要意義。而關于發酵TMR有氧穩定性及其微生物種群多樣性的研究對促進發酵 TMR技術的推廣至關重要。目前，通過傳統分離純化技術、DGGE技術以及高通量測序技術對發酵TMR發酵過程及有氧狀態下的微生物種群多樣性進行了一系列的研究并取得了一定的研究結果，但是仍存在一定的不足。傳統微生物分離鑒定方法由于實驗室培養條件及微生物生長條件的限制，很難對微生物種群整體進行分析。近些年，高通量測序技術已成為研究飼料中微生物組成的常用方法。這種方法能夠對微生物種群進行更全面的分析，但是由于測序的通量較大，所以在確定到菌株水平上的準確率較低；同時，由于高通量測序技術直接提取樣品中的微生物總DNA進行微生物群落的分析，單純的相對豐度并不能顯示實時的微生物組成，因此單純的高通量測序技術在準確分析實時微生物菌群構成上存在一定的缺陷；在提供有關微生物群落代謝活性的定量數據方面也仍然存在問題。在未來的研究中，可以將一二代測序方法結合起來，使二者相互補充，能夠更好地對發酵TMR中的微生物種群進行分析。隨著現代分子生物技術的發展，第三代測序技術（PacBio Single Molecule）越來越多地被應用到青貯飼料發酵過程的微生物種群的測定上，該技術結合實時測序技術（real-time sequencing technology，SMRT）能夠更準確的評估飼料中物種水平上的微生物群落。然而該技術在發酵TMR中的應用還較少，在未來的研究中，利用更新、更高效的現代生物學手段對TMR發酵過程及有氧狀態下的微生物種群進行更深入的分析，并采用代謝組學技術分析優勢微生物的代謝途徑與代謝產物，進一步分析TMR發酵過程中營養成分的代謝規律，為發酵TMR技術的普及和推廣提供堅實的理論基礎。