向日葵HaACO1基因的表達分析及功能驗證

孫瑞芬 張艷芳 牛素清 郭樹春 李素萍 于海峰 聶惠 牟英男

（1. 內蒙古農牧業科學院，呼和浩特 010031；2. 內蒙古農業大學園藝與植物保護學院，呼和浩特 010011）

生物和非生物脅迫是影響植物生長發育和作物產量的重要因素，抗性相關基因的克隆和功能鑒定對采用基因工程手段改良作物抗性非常重要。乙烯（ethylene）是一種植物激素，在植物生長發育、成熟衰老整個生命活動及鹽害、冷害、機械傷害、漬水等逆境脅迫和病原菌入侵中發揮著重要的作用［1］。ACC氧化酶（ACO）是乙烯合成途徑中最后一個酶，直接催化ACC合成乙烯，其活性對乙烯生物合成具有重要的調控作用，因此ACO基因的表達是乙烯形成和應答的主要標志。ACO由多基因家族編碼，目前，已在多種植物上克隆了ACC氧化酶基因，并對其在植物生長發育、成熟衰老等生育過程及激素、環境脅迫、提高作物抗逆性等方面進行了研究。擬南芥AtACO基因家族的6個成員（AtACO1-AtACO6）均可響應水分脅迫，其中AtACO1基因參與植物發育，特別是根系發育［2］。Yuan等［3］從梨的基因組中鑒定了11個ACO基因，其中8個ACO基因在梨的果實中表達，3個ACO基因可被乙烯誘導，表明乙烯是控制更年期果實成熟過程的主要因素。楊樹ACC氧化酶基因Ptre-ACO3和Ptre-ACO6可通過調節乙烯合成而調控楊樹秋葉的衰老［4］。Sornchai等［5］通過導入石斛蘭CpACO基因反義載體延長了石斛蘭花期壽命。孫申申等［6］從“云香”水仙中克隆的新型ACC氧化酶基因NtACOY2參與“云香”水仙花的發育，并且與其花衰老密切相關；在煙草中過表達NtACOY2，2株轉基因煙草分別比野生型煙草提前8d和7d開花。吳建陽等［7］的研究表明荔枝Lc-ACO1基因參與調控荔枝幼果脫落。薛麗君從苧麻中獲得的BnACO1基因參與ABA、干旱、NaCl 脅迫應答［8］。擬南芥中過量表達棉花GhACO2基因，增強了擬南芥耐鹽、耐干旱能力［9］。有關向日葵ACC氧化酶基因相關方面的研究鮮有報道。本研究對前期從鹽誘導向日葵中克隆的ACC氧化酶基因HaACO1（GenBank No. KP966508）［10-11］進行了表達分析及耐鹽功能驗證，為利用該基因進行作物抗逆性狀改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗在內蒙古農牧業科學院生物技術研究中心進行。將向日葵P50種子種植在實驗室蛭石中，待發芽長成幼苗后，分別進行以下處理。（1）按照郭樹春等［12］的方法接種黃萎病病菌（V21），取接種0 d（CK）、1 d、3 d、5 d和7 d植 株 的 葉 片。（2）按照孫瑞芬等［11］的方法，用120 mmol/L NaCl處理向日葵幼苗；用鑷子夾傷葉片遠端邊緣并用大頭針戳3-5下進行損傷處理；將向日葵幼苗置于4℃冰箱進行低溫處理；用5 mmol/L水楊酸噴灑向日葵幼苗。分別取以上不同處理0 h（CK）、2 h、6 h、12 h和24 h植株的葉片。（3）取在1/2 MS營養液中培養4-5 d的向日葵P50幼苗的根、下胚軸和葉片。以上各處理材料于液氮中速凍后，-80℃保存備用。

將本課題組保存的野生型煙草SRI（Nicotiana tabacum）種子，用0.1% HgCl2消毒10 min，無菌水沖洗4-5次，接種到1/2MS固體培養基中，置于植物組織培養室中培養獲得無菌苗，備用。新鮮洋蔥購自市場。瞬時表達載體pCAM-35S-GFP、植物表達載體pPZP221、農桿菌菌株EHA101由本課題組保存。黃萎病病菌（大麗輪枝菌Verticillium dahlia）菌株V21由內蒙古農業大學趙君教授惠贈。利用Primer Premier 5/64軟件設計引物（表1），由南京金斯瑞生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 HaACO1在向日葵中的表達分析 利用TaKaRa公司的RNA提取試劑盒（MiniBEST Plant RNA Exteaction Ki）提取各處理樣品總RNA，通過微量紫外分光光度計（NanoDrop 2000）測其濃度并稀釋到200 ng/μL，以其為模板，利用TaKaRa公司 的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA。根據HaACO1的ORF序列設計引物F1和R1（表1），以向日葵18S rRNA（No.HM638219）為內參基因（引物為F2和R2），利用TaKaRa公 司 的SYBR?Premix EX TaqTMⅡ（Tli RNaseH plus）進行實施熒光定量PCR反應（qRTPCR），重復3次。通過2-ΔΔCT法計算HaACO1的相對表達量，分析其在向日葵根、下胚軸和葉中的表達量及其在生物和不同非生物脅迫條件下的表達模式。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.2 HaACO1亞細胞定位分析 使用ProtComp9.0軟件對HaACO1進行亞細胞定位預測。以克隆載體pT-HaACO1［11］為模板，用引物F3和R3（表1）擴增不含終止密碼子的HaACO1編碼區片段，將其定向連接到瞬時表達載體中的綠色熒光蛋白（GFP）N端，構建融合基因表達載體pCAM-35S-HaACO1-GFP。切取2 cm2×2 cm2新鮮洋蔥內表皮于含4%甘露醇的MS高滲培養基上，25℃預培養4 h。分別制備含有融合基因的表達載體pCAM-35S-HaACO1-GFP和空載體pCAM-35S-GFP（CK）的微金彈，通過基因槍（Bio-Rad）轟擊洋蔥表皮并暗培養24 h以后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察洋蔥表皮細胞中HaACO1-GFP融合蛋白的瞬時表達情況。

1.2.3 HaACO1的過表達分析

1.2.3.1 HaACO1對煙草的遺傳轉化 用引物F4和R4（表1）擴增HaACO1基因編碼區片段，并定向插入到植物表達載體pPZP221的35S啟動子和NOS終止子之間，構建重組表達載體，通過凍融法將其導入農桿菌EHA101感受態細胞中獲得轉化菌株。采用農桿菌介導法轉化煙草葉片并用慶大霉素（50 mg/L）篩選抗性植株。在35S啟動子近3'端序列上設計正向引物p-F（表1）和HaACO1下游引物R4對抗性植株進行PCR和RT-PCR擴增，分別檢測其在DNA水平和RNA水平上的整合和轉錄情況。將RNA檢測陽性植株與野生型植株進一步擴繁株系。

1.2.3.2 轉HaACO1煙草抗逆性鑒定 隨機切取3個轉基因陽性株系和1個野生型（WT）株系相同部位的葉盤，分別接種于含有0和150 mmol/L NaCl的分化培養基上培養10-15 d，觀察葉片顏色變化和分化情況并拍照。

將1個轉基因株系與野生型株系組培苗煉苗后轉移到液體1/2 MS中培養5 d后，分別經4℃低溫、20% PEG6000和150 mmol/L NaCl處理0 h（CK）和24 h取其相同部位葉片，液氮速度后-80℃保存。以煙草EF-1α基因（No. AF120093）為內參基因（引物為F5和R5），用引物F1和R1進行不同脅迫條件下HaACO1的qRT-PCR分析。重復3次。

利用南京建成生物工程研究所的生理生化測定試劑盒，對NaCl處理前、后的轉基因株系和野生型株系葉片進行葉綠素、可溶性蛋白質和脯氨酸含量的測定及POD和SOD活性的測定（測定方法按照試劑盒說明書進行）。以煙草EF-1α為內參基因，利用TaKaRa公司的試劑盒進行抗逆相關基因P5CS、POD、MnSOD、GuZnSOD的qRT-PCR分 析。3次重復。

2 結果

2.1 向日葵不同器官中HaACO1的表達分析

qRT-PCR結果表明，HaACO1在向日葵根、下胚軸和葉中均有表達，其中在葉和下胚軸中的表達量均極顯著高于根中的表達量（P＜0.01），且在葉中的表達量最高（圖1），說明HaACO1存在器官特異性表達差異。

圖1 HaACO1在向日葵不同器官的表達分析Fig.1 Expression of HaACO1 in different organs of sunflower

2.2 HaACO1對生物脅迫的應答分析

由圖2看出，向日葵幼苗接種黃萎病病菌（V21菌株）1、3、5、7 d后分析向日葵葉片HaACO1基因表達情況，發現接種1 d后HaACO1表達量幾乎沒有變化，但第3天和第7天HaACO1表達量迅速升高，極顯著高于0 d（P＜0.01），其中第5天較第3天有所降低，到第7天又升高。由于黃萎病病菌侵入而導致的HaACO1表達量變化，表明該基因在生物脅迫防御調控中發揮作用。

圖2 HaACO1在黃萎病病原菌V21誘導下的表達分析Fig.2 HaACO1 expression under the induction of Verticillium wilt pathogen V21

2.3 HaACO1響應非生物脅迫的表達分析

qRT-PCR分析表明，NaCl、機械損傷、低溫和水楊酸處理向日葵幼苗均可誘導向日葵葉片中HaACO1基因表達，但脅迫條件不同，其表達模式不同。總之損傷處理后HaACO1的相對表達量變化最顯著，依次為水楊酸、低溫和NaCl誘導（圖3）。

圖3 非生物脅迫的不同時間點HaACO1相對表達分析Fig.3 HaACO1 expression at different time under different abiotic stresses

120 mmol/L NaCl處理向日葵幼苗2、12和24 h時，與0 h（CK）相比，HaACO1的相對表達量變化不明顯，但呈上調趨勢，而脅迫6 h時呈現顯著下調表達（P＜0.01）。

向日葵受機械損傷處理后，葉片中HaACO1的表達量變化較為明顯，總體趨勢為先升高后降低。與0 h相比，受損2 h后升高（P＜0.01），6 h達到高峰，之后降低，但均極顯著高于0 h（P＜0.01）。

4℃低溫誘導向日葵幼苗后，葉片中HaACO1的表達量也有變化，總體趨勢為先升高后降低再升高。與0 h相比，處理2 h后HaACO1的表達量升高且到6 h變化平緩，但均高于0 h（P＜0.01），12 h時降低（P＜0.05），24 h時又升高（P＜0.01），且達到峰值。

5 mmol/L水楊酸處理向日葵幼苗后，葉片中HaACO1的表達量表現出明顯的變化，總體趨勢為升高-降低-升高-降低。與0 h相比，處理2、6、12和24 h后，HaACO1的相對表達量均較0 h有所增加（P＜0.01），2 h時葉片中HaACO1相對表達量最高，24 h時最低。

由此表明，向日葵可通過調節HaACO1表達水平防御非生物脅迫造成的傷害。

2.4 亞細胞定位分析

HaACO1亞細胞定位預測結果表明，HaACO1蛋白主要位于細胞質。構建HaACO1基因融合表達載體pCAM-35S-HaACO1-GFP，通過基因槍轟擊轉化洋蔥表皮細胞，借助激光共聚焦顯微鏡觀察，發現空載體的GFP熒光信號分布于洋蔥表皮細胞的細胞膜、細胞質和細胞核各個部位，而HaACO1-GFP融合蛋白的熒光信號主要集中于細胞質（圖4），與ProtComp 9.0軟件預測結果一致。

圖4 融合蛋白HaACO1-GFP在洋蔥表皮細胞中定位Fig. 4 Localization of HaACO1-GFP fusions in onion epidermal cell

2.5 過表達分析

2.5.1 轉基因植株獲得及分子檢測 構建HaACO1基因植物表達載體，通過農桿菌介導法轉化野生型煙草，獲得了慶大霉素抗性煙草植株。隨機選擇11個獨立的抗性植株（編號1-11）分別進行目的基因HaACO1的PCR和RT-PCR檢測。擴增結果顯示，11個植株中有10個植株（2-11）獲得與陽性對照大小一致的條帶（圖5-A），表明HaACO1已整合到煙草基因組DNA中；RT-PCR檢測結果顯示，10個PCR陽性植株中，除5號外其余9個植株均獲得與陽性對照一致的目的條帶（圖5-B），表明該基因在RNA水平上獲得表達。擴繁RT-PCR檢測陽性植株以備后續試驗。

圖5 抗性植株的分子檢測Fig.5 Molecular test of resistant plants with PCR and RTPCR

2.5.2 轉HaACO1煙草抗逆性鑒定 圖6結果顯示，在不含NaCl的分化培養基上，3個轉基因株系（T-4、T-6、T-10）植株離體葉片顏色與野生型煙草均表現正常、分化能力基本一致，而在含有150 mmol/L NaCl培養基上的轉基因植株和野生型植株葉片均表現為顏色變淺，分化能力受到抑制，但轉基因植株葉片受到抑制的程度較野生型煙草的輕，表明轉基因植株較野生型植株對鹽脅迫表現出一定的耐受性。

圖6 鹽脅迫對煙草葉片離體培養的影響Fig.6 Effect of salt stress on in vitro culture of tobacco leaves

對轉基因株系T-10進行qRT-PCR分析表明，正常條件下，T-10與WT煙草葉片中HaACO1的相對表達量基本一致，而受到脅迫后，二者葉片中HaACO1的相對表達量均較CK有不同程度的增加，而且無論是低溫誘導還是PEG、NaCl誘導，轉基因株系T-10中HaACO1的相對表達量均顯著高于WT煙草（P ＜0.01）（圖7），表明逆境脅迫誘導了轉基因煙草中HaACO1的過量表達。

圖7 非生物脅迫條件下轉基因煙草中HaACO1的表達分析Fig. 7 HaACO1 expression analysis in transgenic plants under abiotic stresses

圖8顯示，處理前，轉基因株系T-10與WT株系葉片的葉綠素、可溶性蛋白、脯氨酸含量和POD、SOD活性均基本一致，而用NaCl處理24 h后，各生理生化指標均有變化。其中T-10和WT葉片中的葉綠素含量均較處理前有所下降，但WT葉片中葉綠素含量下降幅度較T-10下降幅度大，且二者呈現極顯著差異（P＜0.01）；T-10和WT葉片中可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、POD活性和SOD活性均較處理前有所增加，且T-10較WT增加顯著（P＜0.01）。由此表明，HaACO1基因在煙草中過表達，可以增加植株可溶性蛋白和脯氨酸的合成以及提高POD和SOD的活性，從而提高煙草對NaCl脅迫的耐受能力。

圖8 轉基因煙草中抗逆相關生理生化指標分析Fig.8 Analyses of physiological parameters related to stress tolerance in transgenic tobacco

圖9顯示，處理前，轉基因煙草株系T-10和WT煙 草 中P5CS、POD、MnSOD和GuZnSOD相對表達量基本一致無顯著差異，而在NaCl處理24 h后，T-10和WT煙草中4個抗逆相關基因的相對表達量均較處理前有所增加，且T-10極顯著高于WT（P＜0.01）。可見，HaACO1過表達誘導了煙草中P5CS、POD、MnSOD、GuZnSOD基因的上調表達，提高了煙草體內的滲透調節和清除活性氧的能力，從而提高了煙草對NaCl的耐受性。

圖9 轉基因煙草中脅迫相關基因的表達分析Fig. 9 Expression analysis of stress-responsive genes in transgenic tobacco

3 討論

植物在其生長、發育、成熟衰老的生命周期中，會受到各種生物和非生物脅迫的影響，乙烯作為氣態植物激素不僅影響植物生長發育的許多方面，而且對多種脅迫都會做出響應［13］。研究表明，ACC氧化酶（ACO）由多基因家族編碼，是催化ACC合成乙烯的最后一個關鍵酶。ACO基因的特異表達，不論是在植物生長發育，還是響應環境脅迫過程中，對乙烯的生物合成都具有重要的調節作用［13-14］。已有研究證實，同種植物的不同ACO成員在器官表達特異性、時空表達、轉錄水平和翻譯水平等不同基因表達層次都存在明顯差異［1］。Takahashi等［15］從萵苣中分離出3種ACO基因，即Ls-ACO1、Ls-ACO2和Ls-ACO3。研究表明，光照可誘導Ls-ACO1和Ls-ACO3積累，低pH（4.0）誘導Ls-ACO2表達，ACC或IAA只誘導Ls-ACO2積累。這些結果表明，生長素、乙烯和光可誘導ACO表達，Ls-ACO2在低pH誘導萵苣根毛形成過程中對乙烯生成起著關鍵作用。Liu等［16］從損傷誘導的向日葵品種Dahlgren 131中克隆了ACCO1及其同源基因ACCO2，并以Ouvrard等［17］分離的向日葵sdi-10為基礎克隆了ACCO3，這3個基因屬于向日葵ACO家族的3個成員。通過損傷和銀離子處理向日葵幼苗，結果表明ACCO1和ACCO2和ACCO3存在器官差異表達，ACCO1主要在根中表達，ACCO2主要在下胚軸和葉中表達，ACCO3在根、下胚軸和葉中均有表達，但ACCO3在ACO總的轉錄產物中只占少量。植物ACO各個成員的表達差異可能是由于上游調控序列的差異所致［18］。百脈根LcACO1在其根、果莢、葉、花中均有表達，且具有一定的組織特異性，其中根中表達量最高，與在果莢、葉、花中的表達量相比有顯著性差異［19］。潘剛［20］報道了分離得到的桑樹MaACO1基因在桑樹葉片形成、雌花發育中的作用以及參與機械損傷與低溫、干旱脅迫的應答。李立芹等［21］研究表明，馬鈴薯StACO1在馬鈴薯根、莖、葉和花的各個組織中均有表達，并且其表達量在根中最高，在葉中的表達量最低，同時發現該基因在高鹽、滲透、低鉀和過氧化氫脅迫后表達量明顯增加，表明StACO1參與馬鈴薯非生物逆境脅迫反應。此外，馬鈴薯StACO1還受到乙烯、生長素、茉莉酸、傷害和真菌誘導表達。Xiao等［22］從匍匐翦股穎中克隆的AsACO在莖中的表達量最高，對乙烯利、茉莉酸甲酯、水楊酸和低溫的反應強烈上調，但對干旱和NaCl處理的反應下調。Shi等［23］分析表明梨的PpACO1和PpACO2基因在梨的果實中有差異表達，且在果實發育的不同時期，2個PpACO的表達量不同。此外，PpACO1在果實中被水楊酸誘導下調；而PpACO2在果實中被水楊酸誘導顯著上調。這些結果表明，梨的PpACO可能參與調節果實成熟和響應水楊酸脅迫。朱家紅等［24］研究表明，乙烯利、低溫和赤霉素均能誘導菠蘿AcACO1的表達。本研究進行了HaACO1在向日葵不同器官中的表達分析，結果表明HaACO1在向日葵根、下胚軸和葉中均有表達，其中在葉中表達量最高，依次為下胚軸、根，與向日葵ACCO2的表達模式相似［16］。進一步對向日葵幼苗進行生物脅迫和不同非生物脅迫前后HaACO1的相對表達分析，表明黃萎病病原菌及NaCl、損傷、水楊酸和低溫處理均可誘導向日葵HaACO1表達，但脅迫條件不同，表達模式不同。ACO基因表達量增加，乙烯合成增多，啟動乙烯信號傳導途徑參與激發植物防御應答［20］。

在ACO基因超表達研究中，張萍等［9］將棉花GhACO2基因導入擬南芥中發現，轉基因擬南芥對鹽脅迫和干旱脅迫的耐受性較野生型擬南芥顯著性增強。孫明明等［25］通過花粉管注射法將花生AhACO1和AhACO2導入花生中，結果表明轉基因植株目的基因的表達量和乙烯釋放量明顯高于非轉基因植株，而且用鹽處理后轉基因植株葉片萎蔫程度相對較輕，推測AhACO基因的過量表達提高了轉基因花生的耐鹽性。李立芹等［21］將馬鈴薯StACO1基因轉入煙草中，在低鉀條件下進行種子萌發實驗發現，轉基因煙草的發芽率明顯優于對照，且根毛數量和長度較對照增加和增長，表明過量表達的煙草通過增加根毛數量與主根長度來適應這種脅迫，促使植物吸收更多鉀離子。在低鉀水培條件下，H2O2含量與對照相比降低，表明過量表達StACO1基因的煙草表現出更強的耐低鉀能力。Ramadoss等［26］將ACO基因轉入擬南芥中，淹水條件下，野生型擬南芥存活時間不到20 d，而轉基因株系存活時間可達35 d，表明過表達ACO基因可提高擬南芥抗淹水能力。

非生物脅迫引起的植物生理生化指標的改變是由植物體內的保護系統和相關基因表達共同調控的［27］。大量研究表明，可溶性蛋白和脯氨酸含量及POD和SOD活性是反應植物逆境脅迫生理生化參數改變的重要指標。植物中的蛋白質合成對非生物脅迫非常敏感。Ban等［28］研究表明，植物蛋白質合成與抗逆性呈正相關，可溶性蛋白水平的增加有助于提高轉基因植物對環境因子（如銅）的耐受性。脅迫條件下，植物體內脯氨酸含量的改變顯示了植物對脅迫的耐受能力，其含量越高，植物的抗脅迫能力越強。SOD、POD等抗氧化酶類作為活性氧的清除劑，可以防止環境脅迫下細胞受到傷害［29］。干旱、冷、熱、鹽脅迫下向日葵葉片和根中脯氨酸增加［30］。Shahbaz等［31］報道了鹽脅迫顯著提高了8個供試向日葵品種的游離脯氨酸含量。在低鉀脅迫下，轉馬鈴薯StACO1煙草的3個株系的脯氨酸、K+和ACC含量及POD酶活性都呈現增加的趨勢，且顯著高于對照，表明過表達StACO1，可增強煙草對鉀脅迫的耐受性［21］。鹽脅迫使光合作用受抑制，也影響光合成分和葉綠體超微結構［32］，從而影響植物生長發育。已有報道顯示，某些外源基因超表達可提高轉基因植物在高鹽脅迫下的葉綠素含量［33］，可以激活一系列脅迫相關基因如P5CS、POD、Cu/ZnSOD、LEA、C2H2、脫水素及冷誘導等基因的表達來提高植株對鹽、干旱、氧化等非生物脅迫的耐受性［28］。Cu/ZnSOD在葉綠體中表達可增強馬鈴薯植株對環境脅迫的耐受性［34］。本研究結果表明在低溫、干旱和NaCl 脅迫下，轉基因煙草的HaACO1表達量高于野生型煙草，說明過度表達向日葵HaACO1提高了煙草對逆境脅迫的抗性。進一步研究表明，NaCl 脅迫下，轉HaACO1煙草中可溶性蛋白含量高于野生型煙草，認為HaACO1可能參與促進蛋白質合成或保護蛋白質合成途徑；轉基因煙草和野生型煙草葉綠素含量降低，但轉基因煙草葉綠素含量高于野生型煙草葉綠素含量，表明NaCl脅迫影響了光合成分葉綠素的合成，導致光合作用受阻，但HaACO1過表達減弱了鹽脅迫對轉基因煙草中葉綠素合成的影響，與煙草離體葉片的耐鹽性實驗結果相符。同時，轉HaACO1煙草中脯氨酸含量和POD、SOD活性及與之相關的P5CS、POD、MnSOD、CuZnSOD基因相對表達量均高于野生型煙草，表明NaCl脅迫下，HaACO1過表達誘導了脅迫相關基因P5CS、POD、MnSOD、CuZnSOD的上調表達，增加了細胞內脯氨酸積累，增強了POD和SOD活性，提高了轉基因煙草的耐鹽性。

4 結論

本研究表明HaACO1在向日葵根、下胚軸和葉不同器官中具有表達特異性；該基因參與生物和非生物脅迫應答，且具有獨特的表達模式。瞬時表達證實其編碼蛋白定位于細胞質，與其行使的功能相一致。煙草中過表達HaACO1基因，提高了轉基因煙草對低溫、干旱和鹽的耐受性；NaCl脅迫后，經過一系列信號傳遞，誘導一些與抗逆相關基因的上調表達，引起與之相關的生理生化參數的相應變化，以增強煙草抵抗鹽害的能力。