煙草單萜合酶基因NtTPS2的克隆及功能鑒定

劉少華 趙希勝，2 楊晴 楊長青 潘旭浩 張建會 楊愛國 李依婷

（1. 中國農業科學院煙草研究所，青島 266100；2. 四川農業大學農學院，成都 611130；3. 四川省煙草科學研究所，成都 610041）

在植物體內，萜類物質主要通過兩條相對獨立的代謝途徑合成，即位于細胞質中的甲羥戊酸（mevalonate pathway，MVA）途徑和位于質體中的甲基赤蘚醇4-磷酸（methylerythritol-4-phosphate pathway，MEP）途徑。萜烯合酶（terpene synthase，TPS）是催化形成萜類骨架的關鍵酶［7］。根據催化機理和形成產物的不同，萜烯合酶被分為Ⅰ類（ClassⅠ）和Ⅱ類（ClassⅡ）［8-9］。其中單萜合酶屬于Ⅰ類萜類合酶，包含保守的DDxxD和NSE/DTE結構域，其中的氨基酸殘基通過結合二價金屬離子來促進異戊二烯焦磷酸基團的電離［10-11］。擬南芥中有多個萜類合酶參與單萜和倍半萜類化合物的生物合成［12-14］，其產物對吸引昆蟲授粉及在植物抵御病原體的入侵中有重要作用［15］。葡萄中已有多個單萜合酶和倍半萜合酶被克隆和功能鑒定，其中包括α-松油醇合成酶，對葡萄繁殖和品種改良具有重要意義［16］。除此之外，萜烯合酶還參與植物對各種生物脅迫和非生物脅迫的響應，如龐強強等［17］對大白菜高溫脅迫前后不同組織和持續高溫脅迫下葉片的表達分析，發現大部分BrTPS可對高溫脅迫產生響應；水稻松油烯合酶OsTPS24參與水稻茉莉酸誘導引發對白葉枯病菌的抗性［18］；OsTPS18參與合成的橙花叔醇可明顯抑制白葉枯病菌的生長［19］等。

茄科植物煙草的次生代謝產物豐富，遺傳轉化和表達體系完善，是研究植物次生代謝的理想植物。目前，煙草萜類物質生物合成途徑上游MVA和MEP途徑中的關鍵合成酶基因已被相繼報道，如1-脫氧木糖-5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS）、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR）、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphatesynthase，GGPPS）、法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，FPPS）等，但是對合成途徑下游的關鍵萜烯合酶基因的研究鮮有報道。在普通栽培煙草中，共有68個TPS基因家族成員［20］，但目前已鑒定并明確功能的寥寥無幾。對煙草萜烯合酶基因的分離鑒定不僅可以完善煙草萜類物質生物合成途徑，還能夠為異源合成煙草萜類天然產物提供基礎元件。

本研究從煙草中克隆了一個定位在質體中的萜烯合酶基因NtTPS2，利用qRT-PCR分析其時空表達模式和對逆境脅迫的響應，并通過大腸桿菌代謝工程鑒定NtTPS2的生化功能，為煙草萜類天然產物的生物合成機理研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用材料普通栽培煙草品種K326（Nicotiana tabacum L.）由國家煙草種質資源中期庫提供。載體質粒pYJM26與pYJM14由中國科學院青島生物能源與過程研究所饋贈；Plant Total RNA Kit購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；Transcript Green One-Step qRT-PCR Supermix、2×Phanta Max Master Mix和2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有 限 公 司；pEASY-Blunt Zero Cloning kit、DH5α Chemically Competent Cell、BL21（DE3）Chemically Competent Cell、EasyPure Quick Gel Extraction kit、DNA凝膠試劑盒，購自北京全式金生物技術有限公司；試驗所用內切酶與連接酶均購自NEB（北京）有限公司。

LB培養基（g/L）：10.0 g蛋白胨、5.0 g酵母粉、10.0 g NaCl，pH 7.0，用于大腸桿菌的培養。

發 酵 培 養 基（g/L）：5.0 g酵 母 浸 粉，1.0 g NH4Cl、15.2 g Na2HPO4·12H2O、3.0 g KH2PO4、0.5 g NaCl、0.48 g MgSO4·7H2O、20 g 葡萄糖，用于大腸桿菌的發酵。

1.2 方法

1.2.1 NtTPS2的克隆及序列分析 萜烯合酶在植物抗逆境脅迫過程中發揮著重要作用。通過對干旱和低溫脅迫處理的煙草轉錄組測序數據的分析篩選，獲得NtTPS2轉錄本序列并設計特異性引物NtTPS2-F和NtTPS2-R（表1）。使 用Plant Total RNA Kit提取煙草葉片總RNA，用超微量分光光度計測定RNA的濃度和純度，利用Transcript Green One-Step qRT-PCR Supermix試劑盒反轉錄，合成cDNA作為基因克隆的模板。使用引物NtTPS2-F和NtTPS2-R，以煙草cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系為cDNA 2 μL、2×Phanta Max Master Mix 25 μL、NtTPS2-F和NtTPS2-R引 物 各2.5 μL，補充ddH2O 18 μL。反應程序為94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個 循 環；72℃ 5 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、純化后，連入pEASY-Blunt Zero Cloning kit載體，轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化子用含有卡那霉素（50 mg/L）的LB固體培養基進行篩選培養12 h，挑取單克隆進行菌液PCR驗證，陽性克隆進行雙向測序，獲得含有NtTPS2序列的陽性質粒Blunt-NtTPS2。

對照組患者單獨采用胺碘酮進行治療，首次劑量為150 mg，溶于20 mL0.9%氯化鈉溶液中，10 min內靜脈滴注完成，間隔15 min后可重復用藥。根據患者病情變化，可適當減少給藥劑量。靜脈給藥停止后，改口服胺碘酮，每天600 mg，聯用7d后，改藥量為每天400 mg，同樣服藥7 d；觀察組患者在此基礎上，聯合服用倍他樂克緩釋片，口服，每次11.875 mg，每天服藥1次，觀察無明顯不良反應后，則每2周增加藥量，達到目標劑量后可長期口服。

利 用ORF finder（http：//www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html）軟件分析NtTPS2開放閱讀框及氨基酸序列；利用在線程序PSORT II Prediction（https：//www.genscript.com/psort.html）預 測NtTPS2蛋白的亞細胞定位；使用InterProScan（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）軟件對NtTPS2蛋白保守結構域進行預測，利用MEGA7軟件鄰接（NJ）法構建系統發育進化樹，Bootstrap值設定為1 000。1.2.2 NtTPS2的組織與時空表達模式 分別提取盛花期煙草根、莖、上部葉、中部葉、下部葉、花瓣、雄蕊和雌蕊的總RNA，反轉錄后，進行qRT-PCR分析。根據NtTPS2序列設計特異性引物NtTPS2-qF和NtTPS2-qR（表1），以煙草Actin為內參，利用2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix進行PCR反應。試驗設置3次生物學重復，2次技術重復。采用2-△△CT方法計算NtTPS2的相對表達量。

1.2.3 不同非生物脅迫處理下NtTPS2的表達分析 將K326種子用75%酒精消毒20-30 s，滅菌ddH2O清洗1遍，用15%過氧化氫溶液浸泡8-10 min，滅菌ddH2O清洗3遍后，播種于1/2 MS固體培養基中。在光照培養箱（16 h光照/8 h黑暗）中培養至兩葉一心，移至1/2 MS液體培養基中培養4周后，分別移入200 mmol/L NaCl、1.0% PEG、4℃、10 μmol/L ABA進行處理。其中，NaCl處理分別在0、1、3、6、12和24 h取樣；4℃處理分別在0、3、6和12 h以及1、3和7 d取樣；PEG和ABA處理分別在為0、6、12、24、48和72 h取樣，每個處理3個生物學重復。每個樣品取樣完成后液氮速凍，-80℃保存備用。

1.2.4 NtTPS2的亞細胞定位 根據NtTPS2的全長CDS序列（去掉終止密碼子）設計帶有Bsa I酶切位點的引物NtTPS2∷gfp-F和NtTPS2∷gfp-R（表1），以Blunt-NtTPS2為模板進行PCR擴增、回收。利用Bsa I對pBWA（V）HS-GLosgfp表達載體和NtTPS2回收片段進行酶切，用T4 DNA連接酶進行連接反應。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，單克隆經PCR及測序驗證，獲得NtTPS2融合GFP的重組質粒pBWA（V）HS-TPS2-GLosgfp。將重組質粒和對照空載質粒pBWA（V）HS-Glosgfp分別轉化農桿菌GV3101。陽性農桿菌菌株經活化和擴大培養后，收集菌體重懸于煙草注射緩沖液（0.2 mmol/L乙酰丁香酮、10 mmol/L MES和10 mmol/L MgCl2）中，調整OD600值為0.7-1.0。重懸液于室溫靜置2-4 h后，用1 mL注射器在本氏煙（Nicotiana bentamiana）中部葉片背面注射。注射后的煙草置于28℃溫室中培養2 d后，在LEICA TCS SP8激光共聚焦顯微鏡下觀察侵染的葉片，確定熒光融合蛋白的定位。

表1 NtTPS2基因克隆、載體構建及qPCR引物Table 1 Primers for NtTPS2 gene cloning，vector construction and qPCR

1.2.5 NtTPS2工程大腸桿菌構建和發酵 將NtTPS2連接到pYJM26質粒的BglII和XhoI雙酶切位點之間，得到重組質粒NtTPS2-pYJM26。pYJM26質粒，即pACY-mvaE-mvaS-GPPS2質粒，攜帶來源于糞腸球菌（Enterococcus faecalis）的乙酰輔酶A酰基轉移酶基因/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（mvaE，GenBank No. AAG02438）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因（mvaS，GenBank No. AAG02439），以及來源于北美冷杉（Abies grandis）的牻牛兒基焦磷酸合成酶基因（GPPS2，GenBank No. AF513112.1）的pACYCDuet-1。參 考Yang等［21］的 方 法 構 建pYJM26質粒載體。以含有NtTPS2 CDS序列的Blunt-NtTPS2質粒為模板，采用NtTPS2-pYJM26-F和NtTPS2-pYJM26-R進行PCR擴增和基因片段回收。將所得NtTPS2片段與pYJM26質粒分別用Bgl II和Xho I進行雙酶切，將載體與外源片段進行連接，得到重組質粒NtTPS2-pYJM26。

將質粒NtTPS2-pYJM26和質粒pYJM14共同轉化E.coli BL21（DE3）感受態細胞，37℃過夜培養后，得到合成香葉醇的大腸桿菌工程菌。pYJM14質粒，即pTrc-low質粒，攜帶來源于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的甲羥戊酸激酶基因（ERG12，GenBank No. NM_001182715.1）、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因（ERG8，GenBank NO. NM_001182727.1）、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因（ERG19，GenBank NO. X97557.1）、異戊烯焦磷酸異構酶基因（IDI1，GenBank NO. NM_001183931.1）的pTrcHis2B。參考Yang等［22］的方法構建pYJM14質粒載體。

挑取平板上的單克隆接種于LB液體培養基中，37℃培養8 h后，將一級種子液按1∶50接種到發酵培養基中，37℃培養至OD600為0.6時添加終濃度為0.3 mmol/L的IPTG，30℃誘導表達繼續發酵48 h。

1.2.6 分析檢測 取發酵液2 mL，12 000 r/min離心1 min，取上清1 mL加入等體積乙酸乙酯于渦旋振蕩器上混勻5 min，然后靜置10 min，取上層有機相進行過濾后，使用氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS，島津TQ8050）檢測發酵產物中天然成分的含量。色譜柱為HP-INNOWAX毛細管柱（30 m × 0.25 mm× 0.25 μm），柱室溫度50℃起步以10℃/min的速度升溫至250℃，保溫5 min，氣化室和檢測室溫度均為250℃。

1.2.7 數據分析 試驗數據采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，由新復極差法分析均值差異的顯著性。

2 結果

2.1 NtTPS2的克隆及生物信息學分析

以煙草葉片總RNA反轉錄獲得的cDNA為模板，利用NtTPS2-F和NtTPS2-R為引物進行PCR擴增，獲得全長為1 854 bp片段，命名為NtTPS2（圖1）。NtTPS2編碼617個氨基酸，其中強酸性氨基酸81個，堿性氨基酸75個，pI為6.35，蛋白分子量為71.73 kD。利用InterProScan在線軟件對其氨基酸序列進行分析，結果表明，NtTPS2具有2個萜烯合成酶基因家族的保守結構域。其中第68-255位氨基酸為萜類合酶N末端區域；第282-606為萜類合酶金屬離子結合結構域（圖2）。

圖1 NtTPS2的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of NtTPS2

圖2 NtTPS2蛋白的保守結構域預測Fig.2 Prediction of the conserved domain of NtTPS2 protein

通過在線程序PSORT II Prediction對NtTPS2蛋白進行亞細胞定位預測，結果顯示NtTPS2在葉綠體、線粒體和質體中定位的概率分別為57.14%、28.57%和14.29%，因此，該蛋白可能是位于葉綠體中。

利用GenBank數據庫蛋白比對程序BLASTP對NtTPS2進行比對分析，選擇與NtTPS2相似度高的萜烯合酶基因，利用DNAMAN軟件進行多序列比對分析，結果（圖3）表明，NtTPS2與已知的萜烯合酶基因蛋白序列具有較高的相似性，且含有萜類合酶催化活性位點“DDxxD”以及NSE/DTE功能域（N，D）D（L，I，V）X（S，T）XXXE。

圖3 NtTPS2與其他植物萜烯合酶基因的多序列比對Fig.3 Multiple sequence alignment of NtTPS2 and other plant terpene synthase genes

為分析NtTPS2與其他物種萜烯合酶基因間親緣關系，通過MEGA7等軟件對NtTPS2進行系統發育進化樹分析。結果（圖4）表明，NtTPS2與矮牽牛、檸檬及柑橘等物種中的單萜合酶基因聚為同一簇，其中與矮牽牛的親緣關系最近，同源性為69.57%，與倍半萜和二萜合酶基因的遺傳距離較遠，推測其可能為一個單萜合成酶。

圖4 NtTPS2與其他物種萜烯合酶系統發育進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of NtTPS2 and terpene synthase of other species

2.2 NtTPS2亞細胞定位

基因的亞細胞定位對研究該基因編碼的蛋白及行使功能的場所至關重要。將含有NtTPS2融合GFP的植物表達載體和僅表達GFP的對照載體分別在本式煙葉片中瞬時表達，通過激光共聚焦顯微鏡觀察發現NtTPS2編碼的蛋白產物定位在葉綠體中（圖5），這一結果與NtTPS2蛋白的亞細胞定位預測結果一致。

圖5 NtTPS2的亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of NtTPS2

2.3 NtTPS2的組織表達分析

利用qRT-PCR技術分析NtTPS2在煙草盛花期各個組織中的相對表達量。結果表明，NtTPS2在煙草各個組織部位均有表達，在根部和雌蕊中的表達量顯著高于莖、葉、花瓣和雄蕊（圖6）。

圖6 NtTPS2的組織表達模式分析Fig.6 Tissue expression pattern analysis of NtTPS2

2.4 NtTPS2對逆境脅迫的響應

萜類化合物在植物抗逆脅迫中發揮著重要的作用。為明確NtTPS2是否參與了煙草抗逆脅迫過程，對普通煙草K326進行了不同逆境脅迫處理，通過qRT-PCR技術對NtTPS2的表達模式進行分析（圖7），發現在200 mmol/L NaCl處理下，NtTPS2表達量在6 h內迅速上調，隨后降低，但12 h時表達量仍顯著高于對照（0 h）；4℃低溫處理下，NtTPS2表達量在6和12 h被快速誘導，隨后急劇下降，7 d后已顯著低于對照（0 h）；10 μmol/L ABA處理下，NtTPS2表達量在6 h內逐漸下調，隨后表達豐度上升，整個處理過程中表達量始終顯著低于對照；用1% PEG模擬干旱脅迫，NtTPS2表達量在48 h內逐漸上調，48 h時出現峰值，隨后下調，到72 h時表達豐度與對照相比沒有顯著性差異。

圖7 不同逆境脅迫下NtTPS2的表達模式分析Fig.7 Expression analysis of NtTPS2 under different stresses

2.5 NtTPS2的生化功能鑒定

以大腸桿菌BL21（DE3）為宿主菌，通過代謝產物分析，鑒定NtTPS2的生化功能。工程菌株經搖瓶發酵培養后，用等體積乙酸乙酯萃取、離心，取上層有機相過濾后用GC-MS檢測發酵產物。對GC-MS總離子色譜圖的分析結果表明，與對照菌株相比，表達了NtTPS2的工程菌株在5.5和5.8 min產生了2種新化合物，譜庫檢索表明可能是香葉醇和橙花醇。進一步利用香葉醇、橙花醇的標準品進行比對，二者的保留時間和質譜數據均一致，表明NtTPS2能夠以GPP為底物生成香葉醇和橙花醇（圖8）。

3 討論

植物單萜合酶催化底物GPP釋放焦磷酸基團，并形成結構不同的單萜類化合物。本研究從煙草中克隆獲得了一個萜烯合酶基因NtTPS2，其包含一個完整的ORF，長度為1 854 bp，編碼617個氨基酸的蛋白質。序列分析表明，NtTPS2與其他植物的萜類合酶蛋白具有較高的保守性，都含有保守的DDxxD和NSE/DTE結構域，該區域能與金屬離子結合，催化萜類化合物的生物合成，屬于典型的I類萜烯合酶［23］。對NtTPS2亞細胞定位的預測和試驗均表明，NtTPS2定位于葉綠體中，與大部分單萜合酶的亞細胞定位相一致。進化分析結果顯示NtTPS2與單萜合酶聚為一類，推測其可能參與煙草中單萜類化合物的生物合成。通過以大腸桿菌為底盤的微生物代謝工程對NtTPS2生化功能的鑒定，進一步證實了NtTPS2是一個單萜合酶，能夠以GPP為底物合成單萜類化合物香葉醇及其異構體橙花醇，是一個香葉醇合成酶（geraniol synthase，GES）。目前編碼GES的基因已在多個物種中被分離和鑒定，如長春花、羅勒、紫蘇、藿香和甜舌草等。但是不同GES基因的表達模式和酶活性卻不盡相同，暗示GES基因在不同物種間的生物學功能存在特異性。

已有的研究表明，萜類化合物在植物抵御逆境脅迫、吸引昆蟲授粉和趨避害蟲等過程中發揮著重要作用。如大豆TPS家族基因可能參與花與根的生長發育［24］；過表達水稻TPS1基因能提高水稻對干旱、高鹽及低溫等逆境的脅迫［25］；冬小麥TPS基因參與其低溫信號轉導過程等［26］。對NtTPS2表達模式的分析發現，NtTPS2的表達具有一定的組織特異性，在根部和雌蕊中的表達量相對較高，且強烈響應低溫、干旱和高鹽等逆境脅迫和ABA信號，暗示著其可能負責煙草根部和雌蕊中香葉醇和橙花醇類揮發性單萜物質的生物合成，在煙草抵御非生物逆境脅迫和授粉生殖等生理過程中發揮著重要作用。

近年來，人們對萜類代謝途徑及其調控機理研究的不斷深入，使得代謝工程成為研究萜類合酶基因及萜類化合物生物合成的有效手段［27］。王詩語等［28］以大腸桿菌為底盤細胞，利用合成生物學手段導入外源雜合蒎烯合成途徑，構建了合成蒎烯的微生物工程菌株；袁雪峰等［29］研究表明，通過構建蝦青素合成相關基因工程菌的發酵試驗，明確了蝦青素的生物合成路徑，并進一步提高了蝦青素的產量和純度；李瑜等［30］利用發酵罐高密度培養番茄紅素生物合成工程菌，并通過優化培養條件及工藝，獲得產量大幅提高的番茄紅素。本研究通過在大腸桿菌中優化萜類物質生物合成途徑，并表達煙草單萜合成酶基因NtTPS2，利用基因工程手段構建了以葡萄糖為原料合成香葉醇和橙花醇的工程菌株代謝途徑，為進一步研究煙草單萜類化合物的生物合成提供理論依據和基礎元件。

4 結論

煙草NtTPS2是一個單萜合成酶基因，包含1 854 bp的ORF，編碼617個氨基酸。該蛋白具有萜烯合酶典型的保守結構域及催化活性功能域。NtTPS2定位于葉綠體中，具有組織表達特異性，受非生物脅迫和植物激素ABA信號誘導。NtTPS2能夠以GPP為底物催化合成香葉醇和橙花醇。