60Co-γ輻射對半夏愈傷組織成苗及植株特性的影響

趙中瑩 李青苗 田孟良 楊小倩 康瑤 邱玉潔 張慶玲 劉帆

（1. 四川農業大學農學院，成都 611130；2. 四川省中醫藥科學院中藥資源與種植研究所，成都 610041；3. 石棉縣農業農村局，雅安 625400）

半夏（Pinellia ternata（Thunb）Brie）為天南星科半夏屬多年生草本植物，該屬植物野生資源豐富，分布廣泛。半夏以塊莖入藥，含生物堿、β-谷甾醇、有機酸等，有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結、抗癌等功效，具有很高的藥用價值［1］。半夏通常以珠芽、種子及小塊莖進行繁殖，繁殖系數低，且此種繁殖方式會引起病毒積累，進而導致半夏塊莖逐漸退化致使藥材質量不穩定，藥效降低，嚴重影響了半夏種植業的發展［2］。因此，利用輻射誘變技術，確定半夏半致死劑量及獲得優良的突變體，為半夏育種提供切實可行的技術方法及基礎性研究材料。

植物誘變技術可加快物種遺傳變異，從而在較短時間內獲得有利用價值的突變體，為選育新品種、新種質及相關功能基因的研究創造條件［3］。輻射誘變育種具有創造多種突變體，豐富種質資源；打破基因連鎖，實現基因重組；保持優良特性，改良個別不利性狀；后代穩定快，育種年限較短等特點。隨著生物技術的發展，輻射誘變技術已被廣泛應用于藥用植物上，如紅花、海州常山、白刺花、人參、陽春砂等［4-8］；國內外學者普遍認為組織培養材料繁殖系數高，敏感性強，突變頻率高，既能降低或避免常規處理易產生嵌合體的問題，提高突變頻率，又能在人為可控的實驗條件下重復多次試驗，使誘變效率得到提高，因此將組織培養技術與輻射誘變技術相結合可提高育種效率［9-10］。植物經射線照射后，部分植株會表現出不同于未經輻射植株的性狀，如葉片增大，增厚、葉色加深，葉形上發生改變，植株粗壯，變矮，花朵變大等［11］。植物接受輻射處理后生理生化指標會發生一定的變化，如植株體內的光合色素量、蛋白質含量、同工酶及過氧化物酶的活性和譜帶等［12］。目前利用60Co-γ射線輻射愈傷組織獲得突變體植株已在藥用植物中有所應用，但使用60Co-γ射線輻射半夏愈傷組織的研究還鮮有報道。

由國內外的研究現狀可知，輻射育種的材料都以農作物和花卉植物為主，有關藥用植物的輻射生物學研究相對零散，因此對60Co-γ射線、離子束注入和空間誘變等不同輻射誘變技術在我國藥用植物育種中的應用還需進行進一步的探索［10］。目前，已有人采用適當劑量的微波輻射提高菘藍、射干、龍膽、北柴胡和丹參等種子的萌發率，縮短萌發時間，使芽的生長速度得到顯著提高［13-14］。在藥用植物育種研究中，張美萍等［15］利用60Co-γ射線照射西洋參的愈傷組織，獲得高產細胞系。本試驗以半夏葉柄為外植體，獲得愈傷組織，以60Co-γ射線為輻射源，采用不同輻射劑量進行處理，篩選出半夏愈傷組織半致死劑量，旨在探究60Co-γ射線對半夏愈傷組織分化成苗及再生植株生長的影響，在短期內獲得優良突變體材料。

1 材料與方法

1.1 材料

由四川喜瑪高科農業生物工程有限公司提供，經四川農業大學田孟良教授鑒定為桃葉型半夏的植株。

1.2 方法

1.2.1 半夏愈傷組織誘導 以半夏葉柄為外植體，采用植物組織培養常規技術進行外植體的表面滅菌，在無菌條件下將半夏葉柄切為0.5 cm小段，接種于前期試驗篩選出的愈傷組織誘導最適的培養基中，即MS+1.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.5 g/L瓊脂粉，pH5.8；培養20 d后得到大量質地一致的黃綠色愈傷組織用于后續試驗。培養條件，溫度（22±2）℃，黑暗培養10 d后進行光照培養，光照強度為30-40 μmol·m-2·s-1，光照時數14 h/d。1.2.260Co-γ射線輻射半夏愈傷組織 本試驗采用單因素試驗設計，輻射劑量分別為0 Gy、15 Gy、20 Gy、25 Gy、30 Gy，輻射劑量率為1 Gy/min，每處理組10瓶，每瓶5塊質地相同的愈傷組織，設3次重復。輻射處理于2019年4月21日在四川省農業科學院輻照中心進行。將不同處理組的愈傷組織進行繼代培養，培養條件同上。繼續培養觀察，待愈傷組織分化形成再生植株后，計算不同處理的分化率、成苗率及死亡率，根據死亡率得出輻射半致死劑量（LD50），即引起50%愈傷組織死亡的輻射劑量。半致死劑量（LD50）的計算方法：本試驗以不同輻射劑量x為自變量，不同劑量下的死亡率y為因變量，利用直線回歸方程y=a+bx和公式LD50=（50-a）/b進行計算。

芽分化率（%）=半夏愈傷組織分化數 /接種的愈傷組織塊數×100%

成苗率（%）=再生植株數/接種的愈傷組織塊數×100%

死亡率（%）=死亡愈傷組織數/接種的愈傷組織塊數×100%

1.2.3 突變體篩選 半夏形態學考察主要包括半夏葉型、株高、珠芽數、塊莖等，其中珠芽作為半夏的繁殖器官，塊莖作為其營養器官為重要考察指標［16-17］。當再生植株根長達到3 cm以上時，已完全展葉，分化出珠芽及塊莖等器官，即可進行觀察測定。統計性狀包括：株高、葉型、珠芽著生位置及珠芽數。對形態變異的再生植株進行進一步的生理生化測定，包括葉綠素含量（分光光度法）［18］、酯酶（EST）同工酶篩選（聚丙烯酰胺凝膠電泳法）［19］。

塊莖大小：用游標卡尺測量半夏塊莖最大直徑。

突變頻率（%）=篩選出的突變體株數/再生植株株數×100%

變異系數：為標準差與平均值之比；株高：用直尺測量半夏根尖到最長葉端的長度；葉型：按長寬比例及最寬的位置來確定；珠芽數：記錄整個生育期內產生的珠芽數。

葉綠素含量測定：取半夏新鮮葉片中間葉片1 cm×1 cm進行測定，設3次重復，計算其平均值。計算公式：

Chla含量（mg/cm2）=（12.7OD663-2.69OD645）×V/（S×1000）

Chlb含量（mg/cm2）=（22.9OD645-4.68OD663）×V/（S×1000）

Chl總含量（mg/cm2）=（20.2OD645+8.02OD663）×V/（S×1000）

OD：測定波長下的吸光度值；V：葉綠素提取液總體積（mL）；S：材料葉面積（cm2）。

1.2.4 統計分析 采用Excel 2013進行數據處理，SPSS 16.0統計軟件進行方差分析及多重比較。

2 結果

2.1 輻射劑量對半夏愈傷組織分化及成苗的影響

由表1可知，在0-30 Gy隨輻射劑量增加芽分化率逐漸降低，表明輻射對半夏愈傷組織分化具有抑制作用（圖1），當輻射劑量為0 Gy，芽分化率最高，為100%（圖2），其次是輻射劑量為15 Gy，芽分化率為72%，輻射劑量為30 Gy，芽分化率最低，為30%。輻射劑量為15-30 Gy時，與0 Gy處理比較，芽分化率差異顯著。在輻射劑量15 Gy及20 Gy處理下，芽分化率差異顯著。在輻射劑量25 Gy和30 Gy處理下，芽分化率差異不顯著，且芽分化率較低。由此說明，輻射劑量在0-30 Gy范圍內，芽分化率與輻射劑量成負相關，死亡率與輻射劑量成正相關，且芽分化率與成苗率相同，即分化出芽即可成苗。各處理再生植株生長情況如圖3所示，0 Gy處理愈傷組織分化苗數最多，隨著輻射劑量的增加，愈傷組織分化苗數逐漸減少，地上部分長勢隨著輻射劑量的增加逐漸變差。

圖1 芽分化抑制Fig. 1 Inhibition of bud differentiation

圖2 芽正常分化Fig. 2 Buds differentiated normally

圖3 不同輻射劑量處理后再生植株生長情況Fig. 3 Growth of regenerated plants treated with different radiation doses

2.2 60Co-γ輻射半夏愈傷組織半致死劑量的確定

通過對輻照劑量與死亡率進行相關性與回歸性分析，得到線性方程為y = 2.3981x - 3.566，相關系數R2=0.960 8，說明半夏愈傷組織死亡率和輻照劑量存在正相關關系。根據直線回歸方程計算出半致死劑量，即半夏愈傷組織的半致死劑量為LD50為22.34 Gy。

2.3 輻射劑量對半夏愈傷組織再生植株形態影響

2.3.1 不同輻射劑量對株高的影響 由圖4可知，突變頻率最高為20 Gy處理，為20.0%，15 Gy次之，為16.9%，25 Gy最低，為11.8%；由圖5可知，20 Gy處理株高變異程度最大，25 Gy處理株高變異程度最低。

圖4 不同輻射劑量處理再生植株株高突變頻率Fig. 4 High mutation frequency of regenerated plants treated with different radiation doses

圖5 不同輻射劑量處理再生植株株高變異系數Fig. 5 Variation coefficient of plant height of regenerated plants treated with different radiation doses

2.3.2 不同輻射劑量對塊莖的影響 由圖6可知，25 Gy處理，塊莖大小突變頻率最高為20.0%，20 Gy處理次之，為11.8%，30 Gy處理中未見塊莖大小變異；塊莖鮮重突變頻率，25 Gy最高為16.8%，其次是15 Gy為13.3%，20 Gy最低為7.8%；由圖7可知，25 Gy及30 Gy處理塊莖鮮重變異程度最大，20 Gy處理塊莖鮮重變異程度最小；25 Gy處理塊莖大小變異程度最大，30 Gy處理塊莖大小變異程度最低。篩選出的變異植株與未經輻射處理比較塊莖大小均低于未經輻射處理；塊莖鮮重表現為，未經輻射處理鮮重均在0.15-0.2 g，15 Gy處理的5株塊莖鮮重在0.1 g以下，8株2.5 g以上，20 Gy處理的2株塊莖鮮重在0.1 g以下，5株2.5 g以上，25 Gy處理的1株塊莖鮮重在0.1 g以下，9株2.5 g以上，30 Gy處理的1株塊莖鮮重在0.1 g以下，4株2.5 g以上。

圖6 不同輻射劑量處理再生植株塊莖大小及鮮重突變頻率Fig. 6 Tuber size and fresh weight mutation frequency of regenerated plants treated with different radiation doses

圖7 不同輻射劑量處理再生植株塊莖大小及鮮重變異系數Fig. 7 Variation coefficient of tuber size and fresh weight of regenerated plants treated with different radiation doses

2.3.3 不同輻射劑量對葉的影響 由圖8可知，葉型突變頻率最高為30 Gy處理，為15.5%，其次是25 Gy處理，為15.2%，最低為15 Gy處理，為8.2%，未經輻射處理葉型為卵形，葉端急尖（圖9-a），葉型變異有闊卵形（圖9-b）、披針形（圖9-c）、闊橢圓形（圖9-d）、闊卵形，裂葉大小不一致（圖9-e）、闊卵形，葉端驟尖（圖9-f）。

圖8 不同輻射劑量處理再生植株葉型重突變頻率Fig. 8 Leaf type mutation frequency of regenerated plants treated with different radiation doses

圖9 輻照處理后代葉型變異情況Fig. 9 Variation of progeny leaf shape after irradiation

2.3.4 不同輻射劑量對珠芽的影響 由圖10可知，突變頻率最高為25 Gy及30 Gy處理，為8.6%，15 Gy與20 Gy處理為2.2%；未經輻射處理半夏株芽位于葉柄中部，且只有一個珠芽（圖11-a），15 Gy、30 Gy處理變異植株珠芽位于葉片基部（圖11-b），20 Gy處理1株變異植株珠芽位于葉片基部（圖11-b），1株變異植株的為雙珠芽（圖11-c），25 Gy處理中1株變異植株珠芽位于葉片基部（圖11-b），1株變異植株為雙珠芽（圖11-c）。

圖10 不同輻射劑量處理再生植株珠芽突變頻率Fig. 10 Bead mutation frequency of regenerated plants treated with different radiation doses

圖11 輻照處理后珠芽變異情況Fig. 11 Variation of bead buds after irradiation

2.4 輻射劑量對半夏再生植株葉綠素含量的影響

葉綠素含量變異程度由圖12可知，30 Gy處理變異程度最大，其次是15 Gy處理，25 Gy處理的變異程度最低，由表2可知，變異頻率最高為25 Gy處理，變異頻率為14.3%，篩選出變異植株9株，其次是30 Gy處理，變異頻率為12.2%，篩選出變異植株6株，20 Gy處理變異頻率最低為8.6%，篩選出變異植株8株，且4組處理間均差異不顯著。

圖12 不同輻射劑量處理葉綠素變異系數Fig. 12 Chlorophyll variation coefficient under different radiation doses

表2 不同輻射劑量處理葉綠素含量變化篩選結果Table 2 Screening results of chlorophyll content under different radiation doses

2.5 輻射劑量對半夏愈傷組織再生植株EST同工酶的影響

由表3及圖13可知，經EST同工酶篩選出的變異植株與未經輻射處理的EST同工酶酶譜在遷移率、酶帶數和酶帶強弱差異顯著。圖上共顯示出18條酶帶，酶帶的Rf值在0.09-0.95之間，篩選出的突變體材料在Rf值=0.09及Rf值=0.86處均與未經輻射處理有相同酶帶。由于遷移率的差異，整個酶譜從負極到正極可劃分為3個區域，即A區、B區和C區，A區Rf值=0.09，B 區Rf值在0.38-0.60，C區Rf值在0.81-0.95。A區有4條酶帶，B區有9條酶帶，C區有5條酶帶。25 Gy與30 Gy處理酶條帶數目最多，說明遺傳性最為豐富。由表4可知，變異頻率最高為30 Gy，變異頻率為8.6%，篩選出變異植株4株，其次是25 Gy處理，變異頻率為7.9%，篩選出變異植株5株，15 Gy、20 Gy處理變異頻率最低，均為2.2%，各篩選出變異植株2株；經酯酶同工酶測定后共獲得13株變異半夏植株（表5）。

表4 不同輻射處理EST同工酶篩選結果Table 4 Screening results of EST isozymes under different radiation treatments

表5 對照處理與突變植株各變異性狀測定結果Table 5 Results of different characters of mutant plants were compared with those of treatment

圖13 EST同工酶圖譜Fig. 13 EST isozyme map

表3 變異植株EST同工酶酶帶數及遷移率結果Table 3 EST isozyme band number and migration rate of mutant plants

3 討論

目前我國半夏品種選育還處于傳統的常規育種技術，遠遠落后于農作物和園藝植物，隨著半夏中藥材產業的發展，半夏生產基地由于缺乏優良品種而限制了其品質和產量的提高，輻射誘變技術可為半夏的品種改良和種質資源的創造開辟新的途徑。

前人研究表明在一定劑量范圍內，60Co-γ射線對愈傷組織分化的抑制作用顯著，且隨著輻射劑量的增加抑制作用逐步加強，如楊麗等［20］利用660Co-γ射線照射白三葉愈傷組織、尚偉等［21］利用60Co-γ射線照射紅掌愈傷組織的研究結果均表現為愈傷組織分化率與輻射劑量成負相關，與本研究結果相同。

大量研究表明適宜的輻照劑量對生物體系的誘變效應至關重要，60Co-γ輻射劑量過高就會造成較高的死亡率，使輻射植株失去篩選機會；劑量不足又無法誘導顯著變異，獲得好的誘變效果［22-23］。由芽分化率結果表明，半夏愈傷組織的半致死劑量在20-30 Gy，與彭文君等［24］對同科植物紅掌愈傷組織60Co-γ輻射得出紅掌愈傷組織半致死劑量范圍在20-30 Gy的研究結果一致，通過直線回歸方程計算得到型半夏愈傷組織半致死劑量為22.34 Gy。

本試驗中經輻射后的半夏愈傷組織部分能夠繼續分化，但分化率受輻射影響顯著，且分化時間與0 Gy處理的愈傷組織相比，時間更長，同時會抑制葉片的分化與生根。輻射后的損傷效應潛伏期較長，隨著植株生長，射線對植株的損傷才逐漸表現出來［25］。經輻射后獲得的部分再生植株，形態上發生不定向變異，植株變矮、葉型、塊莖、珠芽數目及其著生位置均發生變異，這些現象都符合60Co-γ射線對植物生長的誘變效應，與曾文丹［26］輻射木薯，突變植株主要變現在葉形變異或株型變異的研究結果基本一致，且在25 Gy輻射處理下有8株再生植株塊莖鮮重增加，在15 Gy及20 Gy處理下各獲得一株雙珠芽再生植株，可進行后續栽培，以期獲得性狀穩定的變異植株。試驗中發現，部分再生植株的葉綠素含量有所增加，此結果與范菁［27］、李瑜等［28］的研究的結論不一致，可能是因輻射誘變導致半夏再生植株的葉綠素生物合成增強，具體的作用機理有待進一步研究。但葉綠素含量的增高，有利于半夏干物質的積累。由半夏EST同工酶酶譜可以看出，變異植株與未經輻射處理比較差異顯著，具體表現為遷移率、酶帶數和酶帶強弱差異顯著，呈現出豐富的多態性，這與劉波等［29］的研究結果相似，有利于新品系的篩選。

4 結論

本研究共獲得變異植株13株，在25 Gy下突變頻率最高，獲得變異植株5株，該輻射劑量與半致死劑量接近，為最佳輻射劑量，該研究結果可為后續的半夏育種材料的獲得提供試驗依據。