橡膠樹膠孢炭疽菌Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子CgAswA的生物學(xué)功能

劉沙玉 曹健 李蒙 柳志強(qiáng) 李曉宇

（海南大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)院，?？?570228）

橡膠樹作為一種重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，該樹產(chǎn)的橡膠具有良好的絕緣性、彈性、可塑性耐磨等特點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于國防、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、機(jī)械制造和醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域［1］。橡膠炭疽病由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起，是造成橡膠產(chǎn)量下降的主要原因之一。膠孢炭疽菌通常以菌絲體和分生孢子的形式在果實、葉片和枝干等發(fā)病部位進(jìn)行越冬，條件適宜時，分生孢子可以通過風(fēng)雨和昆蟲落在寄主組織表面，隨后孢子萌發(fā)形成芽管、附著胞以及侵染釘，使植物發(fā)病，導(dǎo)致橡膠產(chǎn)量下降［2-3］。膠孢炭疽菌的寄主范圍非常廣泛，對不同植物具有多種侵染策略，對該病菌的防治較為困難［4］。因此，了解膠孢炭疽菌相關(guān)基因在生長發(fā)育及致病過程中的生物學(xué)功能，為深入開展膠孢炭疽菌分子致病機(jī)制研究和防治提供重要的理論和實踐基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中可以特異地識別或結(jié)合到靶基因調(diào)控區(qū)的順式作用元件的核心序列上，參與調(diào)控真菌形態(tài)發(fā)育、寡營養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)、脅迫反應(yīng)和毒素合成等過程，從而調(diào)控病原真菌對寄主的侵染［5-7］。根據(jù)DNA結(jié)合域的空間結(jié)構(gòu)特征，轉(zhuǎn)錄因子主要分為4個家族：鋅指（zinc finger）、螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix，HLH）、螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）、堿基亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）。鋅指蛋白家族根據(jù)其半胱氨酸和組氨酸殘基的數(shù)目和位置將鋅指蛋白分為Cys2His2（C2H2）、Cys4（C4）和Zn2Cys6（C6）三個類群［8］。Zn2Cys6蛋白是真菌中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子。目前，Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子在稻瘟病菌［7，9］、灰霉菌［10］、構(gòu)巢曲霉［11］、禾谷鐮刀菌［12］、馬爾尼菲青霉［13］和黃曲霉［14］等真菌中得到鑒定，參與調(diào)控菌絲生長、孢子萌發(fā)、附著胞形成、外界脅迫應(yīng)答反應(yīng)、次生代謝產(chǎn)物的形成、色素及毒素的產(chǎn)生和致病性等重要生理過程。然而，目前關(guān)于膠孢炭疽菌Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子的研究較少。本研究從膠孢炭疽菌中克隆出一個Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子，其與黃曲霉中的aswA基因同源，將該轉(zhuǎn)錄因子命名為CgaswA，通過同源重組的方法獲得該基因的敲除突變體，并構(gòu)建其互補(bǔ)株，通過表型分析確定CgaswA的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 菌株膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeospo-rioides）野生型菌株由海南大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)院保存。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ，HindⅢ，XbaⅠ）及 PCR試劑等均購自 TaKaRa 公司；引物合成和測序均由上海生工生物工程股份有限公司完成；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 MM培養(yǎng)基（g/L）葡萄糖 10.0 g、NaNO31.0 g、MgSO40.5 g、K2HPO41.0 g、FeSO40.01 g、KCl 0.5 g、瓊脂粉 18.0 g。PDA培養(yǎng)基、CM培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和Czapek培養(yǎng)基的配方均參照文獻(xiàn)［15］。

1.2 方法

1.2.1 CgaswA基因的克隆及序列分析利用 TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa，中國）提取膠孢炭疽菌總RNA，采用 PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，中 國）合成 cDNA。以膠孢炭疽菌cDNA為模板，利用引物CgaswAF 和 CgaswAR（表 1）擴(kuò) 增CgaswA的ORF框，該P(yáng)CR 產(chǎn)物經(jīng)切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定后送上海生工測序公司測序。利用 SMART（http：//smart. embl-heidelberg. de/）預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)域，從GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）下載不同真菌CgAswA的同源序列。使用Clustal_W進(jìn)行序列比對，并利用MEGA7.0軟件采用鄰近相接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（No.of Bootstrap：1 000；Model/Method：Poisson model；Rates among Sites：Uniform rates；Gaps/Missing Data Treatment：Complete deletion）。利用NovoPro（https：//www.novopro.cn/）預(yù)測蛋白質(zhì)核定位信號。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primer and sequence

1.2.2 CgaswA基因的敲除和互補(bǔ) 圖1為CgaswA基因敲除原理圖。參照文獻(xiàn)［16］的方法提取膠孢炭疽菌基因組DNA，利用引物CgaswAupF和CgaswAupR，CgaswAdownF和CgaswAdownR（表1）擴(kuò)增CgaswA基因的上下游序列。將該基因上下游片段回收純化后依次連接到 pCB1532載體，酶切驗證無誤，得到敲除載體pKno-CgaswA。將pKno-CgaswA用EcoRⅠ 酶切線性化后，轉(zhuǎn)入膠孢炭疽菌野生型菌株的原生質(zhì)體中，原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化方法參照文獻(xiàn)［17］。轉(zhuǎn)化子在含有氯嘧磺隆（100 μg/mL）的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選后，提取抗性轉(zhuǎn)化子的基因組，利用3對引物CgaswAF+ CgaswAR、CgaswAUU+PI、CgaswADD+PI1（表1）對 轉(zhuǎn) 化 子 進(jìn) 行PCR驗證，引物的設(shè)計位點(diǎn)如圖1所示：引物CgaswAF+CgaswAR擴(kuò)增不出目的條帶，而引物CgaswAUU+PI、CgaswADD+PI1 能擴(kuò)增出目的條帶的轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子。

圖1 CgaswA基因的同源重組原理Fig. 1 Homologous recombination principle of the gene CgaswA

以膠孢炭疽菌基因組DNA為模板，利用引物CgaswAhbF和CgaswAhbR擴(kuò)增CgaswA基因的互補(bǔ)片段，將該片段與潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPT）的DNA片段（來自質(zhì)粒pCB1003）相連后，連接到pUC18質(zhì)粒上，得到互補(bǔ)載體pComp-CgaswA。將互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)化到CgaswA敲除突變體制備的原生質(zhì)體中，轉(zhuǎn)化制備方法如上所述。將轉(zhuǎn)化子在含有潮霉素（300 μg/mL）的平板上篩選。以轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，以CgaswAF 和CgaswAR為引物，進(jìn)行PCR驗證，能擴(kuò)增出CgaswA基因片段的為互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子。

1.2.3 突變體表型分析

1.2.3.1 營養(yǎng)生長和脅迫因子敏感性分析 用直徑5 mm的打孔器在活化7 d的野生型菌株、敲除突變株和互補(bǔ)株的菌落邊緣打取菌餅，分別接種到PDA、CM、Czapek和MM固體培養(yǎng)基上，每處理設(shè)3個重復(fù)，28℃培養(yǎng)7 d，測量菌落的直徑。

將不同菌株的菌餅接種至含有山梨醇（濃度為1.0 mol/L），甘油（濃度為1.0 mol/L），NaCl（濃度為0.8 mol/L），H2O2（濃度為10 mmol/L）以及 0.01%SDS（sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉）的MM平板上，每處理設(shè)3個重復(fù)。28℃培養(yǎng)7 d后觀察，計算抑制率。

1.2.3.2 分生孢子產(chǎn)量、萌發(fā)及附著胞的形成 將野生型菌株、敲除突變株和互補(bǔ)株于PDA平板活化7 d后，用打孔器打取菌落邊緣的菌餅接種至PDB培養(yǎng)基中，在28℃，150 r/min下培養(yǎng)2 d后，過濾除菌絲，取濾液7 000 r/min，離心8 min，棄上清，用無菌水洗3次，使用血球計數(shù)板統(tǒng)計分生孢子數(shù)量。將25 μL孢子懸浮液滴在載玻片上，28℃培養(yǎng)4 h、8 h、12 h后，在顯微鏡下觀察，計算孢子萌發(fā)率和附著孢形成率。

1.2.3.3 洋蔥表皮和玻璃紙的穿透試驗 撕取洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，用無菌水洗3次，然后將其平鋪于滅菌的載玻片上。取孢子懸浮液10 μL（濃度為：5×103個/mL）滴于洋蔥表皮，28℃培養(yǎng)8 h和12 h后觀察附著胞的穿透和侵入，每處理設(shè)3個重復(fù)。

將玻璃紙平鋪在PDA培養(yǎng)基上，取20 μL（濃度為：5×105個/mL）孢子懸浮液和菌餅分別接種于玻璃紙上。28℃培養(yǎng)2 d和3 d，分別揭去玻璃紙，并再培養(yǎng)1 d后觀察，每處理設(shè)3個重復(fù)。

1.2.3.4 致病性分析 （1）活化7 d的野生型菌株、敲除突變體和互補(bǔ)株P(guān)DA平板上打取5 mm膠孢炭疽菌菌餅，以有傷的方式接種到離體橡膠葉片表面，28℃保濕，2 d后將菌餅揭去，4 d后觀察發(fā)病情況，每處理設(shè)3個重復(fù)。（2）將野生型菌株、敲除突變株和互補(bǔ)株分生孢子懸浮液濃度調(diào)至1×106個/mL，取20 μL孢子懸浮液以有傷的方式接種到離體橡膠葉片表面。28℃保濕，5 d后觀察發(fā)病情況，每個處理設(shè)3個重復(fù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)的運(yùn)算和處理，采用IBM SPSS Statistics 23.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行單因素試驗統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 CgaswA基因的克隆及序列分析

通過PCR擴(kuò)增獲得了CgaswA基因的ORF框，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CgaswA基因ORF框全長2 142 bp（GenBank登 錄 號：MW324529），編碼蛋白長度713個氨基酸，含有一個GAL4結(jié)構(gòu)域（GAL4-like Zn（II）2Cys6 binuclear cluster DNAbinding domain）、一 個AT_ hook結(jié) 構(gòu) 域（DNA binding domain with preference for A/T rich regions）和一個真菌特異轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域，為Zn2Cys6型鋅指蛋白（圖2-A）。CgaswA在GenBank中利用BLASTp工具進(jìn)行比對，將其在12種不同真菌中的同源蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2-B）。CgAswA蛋白在炭疽菌屬里比較保守，與C. fructicola（KAF4888992.1）和C. siamense（XP_036493040.1）中的同源蛋白的相似度都在99%以上，此外CgAswA與Verticillium longisporum、Stachybotrys chartarum、Fusarium graminearum、Fusarium oxysporum、Valsa mali和Pyricularia oryzae中同源蛋白的相似度較高，均在48%以上，而與Saccharomyces cerevisiae同源蛋白的相似率較低，僅為26%。經(jīng)NovoPro預(yù)測，CgAswA蛋白在128-143個氨基酸之間有一段核定位信號序列（KQKRPRGRPRKHPLAP），概率為94.6%。

圖2 CgAswA蛋白結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Protein domain and phylogenetic tree of CgAswA protein

2.2 CgaswA基因的敲除和互補(bǔ)

對基因敲除載體pKno-CgaswA線性化后，轉(zhuǎn)入野生型原生質(zhì)體中，共得到105個轉(zhuǎn)化子。提取全部轉(zhuǎn)化子基因組，利用CgaswAF+CgaswAR、CgaswAUU+PI、PI1+CgaswADD三對引物（引物的設(shè)計位點(diǎn)詳見圖1）進(jìn)行3輪PCR驗證。結(jié)果顯示3號、8號和11號轉(zhuǎn)化子利用引物CgaswAF+CgaswAR無法擴(kuò)增出CgaswA基因ORF框的目的條帶，且引物CgaswAUU+PI和PI1+CgaswADD能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的條帶（圖3-A和B）。最終確定3號、8號和11號轉(zhuǎn)化子為敲除轉(zhuǎn)化子，分別命名為ΔCgaswA-3、ΔCgaswA-8和ΔCgaswA-11（圖3）。

將互補(bǔ)載體pComp-CgaswA轉(zhuǎn)化到已敲除突變株ΔCgaswA-11制得的原生質(zhì)體中，在含有潮霉素的平板上篩選，共獲得32個抗性互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR驗證，發(fā)現(xiàn)16號轉(zhuǎn)化子利用引物CgaswAF+CgaswAR可擴(kuò)增出CgaswA基因ORF框的目的條帶，確定其為互補(bǔ)株，命名為ΔCgaswA/aswA（圖3-A）。

圖3 CgaswA 基因的敲除和互補(bǔ)驗證Fig. 3 Verification of CgaswA gene knockout and complementation

2.3 突變體表型分析

2.3.1 CgaswA對膠孢炭疽菌營養(yǎng)生長和脅迫因子的影響 野生型菌株、敲除突變體ΔCgaswA和互補(bǔ)株在4種培養(yǎng)基中的生長情況見圖4-A。敲除突變體ΔCgaswA較野生型菌株及互補(bǔ)株生長緩慢，尤其在CZAPEK培養(yǎng)基上，野生型菌株培養(yǎng)7 d的直徑為7.93 cm，而突變體的菌落平均直徑為6 cm，差異顯著（P＜0.05），互補(bǔ)株的生長速率與野生型菌株相似（圖4-B）。

圖4 菌株在4種培養(yǎng)基上生長情況比較Fig. 4 Comparison of strains’ growth on four media

將菌株接至含不同脅迫因子的MM平板上，結(jié)果表明，同野生型相比，1.0 mol/L山梨醇，1.0 mol/L甘油，0.8 mol/L NaCl，10 mmol/L H2O2和0.01%SDS對突變體生長的抑制作用并不顯著。以上結(jié)果說明CgAswA參與調(diào)控膠孢炭疽菌的營養(yǎng)生長。

2.3.2 CgaswA突變體的分生孢子產(chǎn)量、萌發(fā)及附著胞的形成 與野生型相比，敲除突變株ΔCgaswA產(chǎn)生的分生孢子明顯較少，互補(bǔ)株的分生孢子產(chǎn)量與野生型相似（圖5-A）。野生型菌株的孢子在4 h萌發(fā)率為85.87%，敲除突變體ΔCgaswA在4 h時，孢子的萌發(fā)率僅為32.54%，附著胞的形成率也明顯低于野生型，只有28.84%；隨著時間的延長，12 h時，敲除突變體的孢子萌發(fā)率和附著胞的形成率分別增加到71.94%和69.41%（圖5-B-C）。從整體上來看，敲除突變體ΔCgaswA的孢子萌發(fā)和附著胞的形成較野生型滯后（圖5-D）。由此可見，CgAswA參與調(diào)控膠孢炭疽菌的分生孢子產(chǎn)生、孢子的萌發(fā)和附著胞形成。

圖5 野生型、ΔCgaswA與ΔCgaswA/aswA分生孢子的產(chǎn)生、萌發(fā)和附著胞的形成Fig. 5 Sporulation，germination and appressorium formation of wild type，ΔCgaswA and ΔCgaswA/aswA

2.3.3 洋蔥表皮和玻璃紙穿透試驗 為了了解突變體的附著胞是否能進(jìn)一步發(fā)育成侵染結(jié)構(gòu)，在洋蔥表皮細(xì)胞和玻璃紙上分別進(jìn)行了穿透試驗。由圖6-A可以看出，野生型菌株在洋蔥表皮細(xì)胞上，8 h后附著胞開始分化出侵染結(jié)構(gòu)，12 h后進(jìn)一步形成明顯的侵染菌絲，敲除突變體ΔCgaswA在8 h僅部分附著胞開始分化出侵染結(jié)構(gòu)，12 h雖然大部分附著胞分化出侵染結(jié)構(gòu)，但該侵染結(jié)構(gòu)明顯小于野生型，互補(bǔ)株基本能恢復(fù)到野生型水平。

在玻璃紙穿透試驗中，無論是分生孢子懸液還是菌餅接種，野生型菌株、敲除突變體ΔCgaswA和互補(bǔ)株都能穿透玻璃紙，在2 d形成菌落，但敲除突變體ΔCgaswA形成的菌落比野生型小，互補(bǔ)株與野生型菌株無顯著差異（圖6-B）。以上結(jié)果表明，CgAswA參與調(diào)控膠孢炭疽菌的侵入過程。

圖6 洋蔥表皮侵染和玻璃紙穿透試驗Fig. 6 Onion epidermis infection and cellophane penetration assays

2.3.4 致病性分析 將野生型菌株、敲除突變株ΔCgaswA與互補(bǔ)株ΔCgaswA/aswA的菌餅和孢子懸浮液分別接種到有傷的離體橡膠樹葉片上。敲除突變體ΔCgaswA形成的病斑明顯小于野生型，其致病力明顯減弱，互補(bǔ)株ΔCgaswA/aswA基本可以恢復(fù)到野生型水平（圖7）。此結(jié)果說明CgAswA參與調(diào)控膠孢炭疽菌的致病力。

圖7 野生型、ΔCgaswA與ΔCgaswA/aswA致病性分析Fig. 7 Pathogenicity analyses of wild type，ΔCgaswA and ΔCgaswA/aswA

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控真菌生長發(fā)育及致病過程中起著重要的作用。本研究從膠孢炭疽菌中鑒定了一個Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子CgAswA，獲得其敲除突變株ΔCgaswA。ΔCgaswA在Czapek和MM培養(yǎng)基上生長速率明顯低于野生型，孢子產(chǎn)量顯著低于野生型菌株，孢子萌發(fā)和附著胞形成較野生型滯后。在洋蔥表皮和玻璃紙上，突變株孢子形成的侵染結(jié)構(gòu)較野生型延遲，且穿透能力明顯減弱，在橡膠葉片上致病力也減弱。目前關(guān)于CgaswA同源基因功能的研究較少，僅在曲霉中有報道。在黃曲霉中，CgaswA的同源基因aswA參與調(diào)節(jié)菌核發(fā)育，同時影響菌核中特異性代謝物的生物合成和積累［14］。在構(gòu)巢曲霉中，aswA的同源基因是oefC（over-expressed fluffy），該基因過量表達(dá)時，形成大量的氣生菌絲，但對于該基因是否參與無性產(chǎn)孢等生理過程，并未有報道［18］。

研究發(fā)現(xiàn)，Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子在不同真菌中的功能并不保守，此類轉(zhuǎn)錄因子在進(jìn)化過程中功能不斷分化，參與調(diào)控不同的生長發(fā)育過程［19］。在禾谷鐮刀菌中，EBR1參與調(diào)控菌絲生長、分生孢子的產(chǎn)生、萌發(fā)和致病性［12］。RosA和NosA是構(gòu)巢曲霉有性發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，過表達(dá)RosA導(dǎo)致菌絲生長減少，且RosA可抑制NosA的表達(dá)［20-21］。在大麗輪枝菌中，VdFTF1參與調(diào)控細(xì)胞壁降解酶相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響其致病性［22］。在稻瘟病菌中，GCC1、GPF1和GTA1參與調(diào)控菌絲生長，其中敲除突變體Δgpf1完全喪失對水稻的致病能力［23］。在梨樹腐爛病菌中，VpPf2不影響該病菌的生長、菌絲形態(tài)和分生孢子形成，但參與調(diào)控細(xì)胞壁的完整性與致病性［24］。

在膠孢炭疽菌中，也有一些轉(zhuǎn)錄因子得到研究。bZIP型轉(zhuǎn)錄因子CgAP1參與調(diào)控該菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)和致病力［25］。C2H2型轉(zhuǎn)錄因子pacC作為一種重要的pH調(diào)節(jié)因子，調(diào)控許多在堿性條件下表達(dá)的致病基因［26-27］。C2H2型轉(zhuǎn)錄因子CgAzf1參與調(diào)控黑色素的合成、分生孢子發(fā)育和致病力［28］。SltA和CrzA也是C2H2型轉(zhuǎn)錄因子，其中SltA參與調(diào)控膠孢炭疽菌附著胞的形成及致病性，而CrzA參與調(diào)控生長，分生孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)，附著胞的形成和致病性［29］。本文所研究的Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子CgAswA參與調(diào)控營養(yǎng)生長、分生孢子發(fā)育和致病力，這將為膠孢炭疽菌中Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子的功能研究添加新的內(nèi)容，同時也為深入認(rèn)識該病原菌致病的分子機(jī)理奠定一定的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

在膠孢炭疽菌中，CgAswA是一個Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控該病原菌的營養(yǎng)生長、分生孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)、附著胞的形成、侵入及致病性。