葡萄糖-木糖共利用對重組大腸桿菌合成D-1，2，4-丁三醇的影響

劉雪丹 楊萌 張靜 趙東旭

（1. 鄭州大學化工學院，鄭州 450001；2. 北京理工大學生命學院，北京 100081）

D-1，2，4-丁三醇（BT）是含有3個羥基似甘油的 C4化合物，應用廣泛［1］。如合成比天然橡膠更高彈性的聚氨酯發泡劑；脫水可得制抗 HIV 藥物Amprenavir 的關鍵前體—3-羥基四氫呋喃［2］，還可用作藥物緩釋劑［2-3］等。BT 最重要的應用是合成含能材料 1，2，4-丁三醇三硝酸酯（BTTN）［4］，與硝酸甘油相比，BTTN 具有沖擊靈敏度低、熱力學穩定性高和揮發性低等優點［2］，是硝酸酯增塑聚醚推進劑的重要組成部分［5］。

傳統的BT合成方法是通過 NaBH4催化還原蘋果酸［3］，此方法反應條件苛刻，副產物多、產率低、還會產生大量有害廢棄物［6］。Cao等［6］和Yamada-Onodera等［7］首次實現利用微生物合成 BT，首先由莓實假單胞菌將木糖氧化成木糖酸，然后采用重組菌株將木糖酸轉化為丁三醇。其后研究人員將用于丁三醇合成的酶全部表達到大腸桿菌中，簡化了 BT合成路線［1，8-9］，如圖 1 所示。

圖1 D-木糖合成D-1，2，4-丁三醇的主要代謝途徑Fig. 1 Main metabolic pathways of D-xylose to synthesize D-1，2，4-butanetriol

丁三醇的生物合成主要以木糖為底物，在培養體系中加入葡萄糖形成雙底物體系，可以提高 BT合成效率［2，10］。但菌株在培養時出現二次生長現象［11］，即碳代謝物阻遏效應（CCR 效應）［12-15］，影響了菌株對木糖的利用。馬鵬飛等［8］和Zhang等［9］構建了缺失葡萄糖特異性滲透酶 EIIBCGlc（由ptsG 編碼）弱化 CCR 效應的菌株，初步探討了弱化CCR 效應對 BT 合成可能產生的影響。除 EIIBCGlc外，其它非磷酸轉移酶系統（PTS）系統中的蛋白也對菌株的 CCR 效應產生影響。pgi（編碼磷酸葡萄糖異構酶）［16］和 mtfA（編碼葡萄糖-磷酸轉移酶系統的調節輸出信號蛋白）［17］的缺失降低了 ptsG 的表達，弱化菌株的 CCR 效應，而 mlc（編碼碳水化合物代謝的全局抑制因子）［18］的表達則會有相似的作用。有關CCR效應對BT合成的影響還未見進一步報道。

影響CCR效應不同的基因具有不同功能，敲除（過表達）這些基因對CCR效應影響程度不一致，對細胞代謝系統也會造成不同的影響。為考察不同影響CCR效應的方式對 BT 合成的影響，本論文構建了一系列擾動 CCR 效應的菌株，研究雙底物合成體系中葡萄糖對 BT 合成的促進作用，并對發酵條件進行了優化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒 本實驗所用的菌株和質粒以及引物分別列于表 1 和表 2。

表1 本研究所用的菌株及質粒Table 1 Strains and plasmids in this study

表2 本研究所用的引物Table 2 Primers in this study

1.1.2 實驗試劑 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG） 購 自Biotopped 公司，氨芐青霉素鈉和硫酸卡那霉素（kanamycin）購自 Sigma 公司，酵母粉和蛋白胨購自Oxoid 公司，葡萄糖與氯化鈉購自國藥集團，木糖是購自山東福藥集團。

1.2 方法

1.2.1 基因敲除方法 采用 Red 同源重組法［19］。本研究利用 Red 重組技術敲除了 BT 合成菌株MJ133k-1 的ptsG、pgi、mlc 和 mtfA 等4個基因，得到 了MJ134k-1、MJ133k-Δpgi-1、MJ133k-Δmlc-1、MJ133k-ΔmtfA-1 等4個菌株。

1.2.2 培養基與發酵條件 （1）種子培養基和培養方法：種子培養采用 LB 液體培養基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，滅菌后加入 1 mg/mL的氨芐青霉素。添加 15 g/L的瓊脂可得到 LB固體培養基。挑取于 -80℃ 保存的菌株在固體 LB 培養基上活化 2 次，培養溫度為 37℃。挑取單菌落于LB 液體培養基中，于 37℃、轉速 190 r/min的搖床中培養 14-16 h至OD6005-6 之間，用于接種發酵培養基。（2）發酵培養基和發酵條件：發酵培養基：胰蛋白胨 15 g/L，酵母提取物 7.5 g/L，NaCl 15 g/L，CaCO310 g/L，滅菌后加入 1 mg/mL的氨芐青霉素。將種子培養基按 10% 接種量轉接至含有 50 mL發酵培養基體積為 250 mL 的三角瓶中，6 h 后加入終濃度為 0.8 mmol/L 的 IPTG、葡萄糖 5 g/L和木糖 20 g/L，24 h時再加入葡萄糖 5 g/L。培養溫度 33℃，搖床轉速 190 r/min。所有實驗設置3個平行實驗。

1.2.3 檢測方法 細胞量采用濁度法測定［20］。取 2 mL 發酵液，12 000 r/min 離心 2 min，收集沉淀用1 mol/L HCl 重懸，再次用 12 000 r/min 離心 2 min，收集沉淀并用生理鹽水洗滌兩次，稀釋合適倍數。采用 UV-VI 型分光光度計（北京普析通用公司），在波長 600 nm 下測量菌懸液的濁度。

葡萄糖、D-木糖、BT 等濃度的測定采用高效液相色譜（HPLC）法測定。取 2 mL 菌液樣品，12 000 r/min 離心 2 min，取上清，用 0.22 μm 水系膜過濾后的清液進樣。檢測設備及條件：島津LC-15C 型 HPLC，配置 RID-10A 示差折光檢測器、Aminex HPX-87H 色 譜 柱（300 mm×7.8 mm，Bio-Rad，USA）；柱溫 55℃，進樣量 20 μL；5 mmol/L 的H2SO4為流動相，流速 0.6 mL/min；LC solution 工作站采集及分析數據。

2 結果

2.1 弱化CCR效應對菌株底物利用及BT合成的影響

為進一步了解葡萄糖、木糖的共利用在 BT 合成過程中的作用，通過敲除 BT 合成菌株的 ptsG、mtfA、pgi 等基因弱化了菌株的 CCR 效應，考察菌株培養時葡萄糖和木糖的利用情況，以及對 BT 合成的影響。圖 2-A 表明 BT 合成菌株敲除 ptsG、mtfA、pgi 等基因后，影響了葡萄糖轉運效率，葡萄糖利用速率下降。從圖 2-B 可以看出葡萄糖利用速率下降導致了 CCR 效應的弱化，進而使木糖利用速率顯著提高。圖 2-C表明弱化 CCR 效應菌株合成 BT 的能力均得到提高。54 h 時，相對于對照菌株培養液中殘余葡萄糖為 0，敲除了 mtfA 的菌株殘余葡萄糖最多，為 1.04 g/L，但木糖消耗卻最快。mtfA 的敲除使菌株在葡萄糖較高濃度時加快木糖的吸收利用，為BT 合成提供充足的前體，BT 的產量也由改造前的0.81 g/L 提高到 2.21 g/L。

2.2 強化CCR效應對菌株底物利用及BT合成影響

為進一步了解CCR 效應對重組菌株葡萄糖-木糖共利用的影響，過量表達了ptsG、mtfA、pgi等基因，考察這些基因對底物利用和BT合成的影響。由圖3-A可以看出，過表達不同基因后，不同菌株葡萄糖的消耗幾乎一致，在 30 h 和 54 h 時均無剩余。圖3-B 結果顯示，發酵結束后，不同菌株木糖剩余量均在19 g/L 左右，基本未消耗。圖 3-C 表明，過表達與共利用有關的不同基因后，BT的產量明顯下降，約為對照菌株MJ133k-1 BT 產量的50%。說明CCR效應不利于 BT 的合成。

圖3 強化CCR效應菌株的葡萄糖、木糖利用及BT合成Fig. 3 Effect of enhancing CCR on glucose and xylose utilization and BT production by recombinant strains

2.3 全局抑制因子Mlc對菌株底物利用及BT合成影響

mlc 基因編碼的 Mlc 蛋白是一個全局抑制因子（global repressor），抑制 ptsG 的表達，有利于葡萄糖-木糖共利用。在 BT 合成菌株中敲除或過量表達該基因，以減輕或強化該全局抑制因子對 ptsG 表達的抑制，以進一步考察 CCR 效應對菌株共利用葡萄糖、木糖以及對 BT 合成的影響。對照圖 2、圖 4可以看出 mlc 敲除菌株葡萄糖與木糖的利用情況與MJ133k-1 菌株基本一致，培養 54 h 后，葡萄糖無剩余，木糖幾乎未消耗，表明菌株沒有出現共利用葡萄糖、木糖的表型，與之對應 BT 的產量為 0.19 g/L，僅為原始菌株產量的 23.7%。但在敲除 mtfA 基礎上過表達 mlc 得到的菌株葡萄糖與木糖的利用情況與菌株 MJ133k-ΔmtfA-1一致，54 h后BT產量為2.61 g/L，與MJ133k-ΔmtfA-1相比產量提高了 18.1%。

圖2 弱化CCR效應菌株的葡萄糖、木糖利用及BT合成Fig. 2 Effect of weaking CCR on glucose and xylose utilization and BT production by recombinant strains

圖4 全局抑制因子Mlc對共利用的影響Fig. 4 Effect of global repressor Mlc on co-utilization

2.4 培養條件對葡萄糖-木糖雙底物合成BT的影響

為進一步提高采用雙底物合成 BT 的效率，開展了 mtfA 基因缺失、mlc 過表達的菌株 MJ133k-ΔmtfA-PTMXM 培養條件研究。培養溫度對菌株合成BT 的影響如圖 5-A所示，當溫度為 33℃ 時，BT的產量達到最高為 2.61 g/L。通過在培養基中添加 10 g/L的 CaCO3或堿式 MgCO3，在發酵過程中維持不同的pH，研究不同 pH 對菌株產BT能力的影響。由圖 5-B可知，添加 CaCO3控制發酵過程中 pH 在接近中性條件下 BT 產量最高。

考察培養基濃度、裝液量這兩個參數對 BT 產量的影響。圖 5-C表明當培養基濃度為 1×LB 和2×LB 時，BT 產量比采用 1.5×LB 培養基時分別減少了 66.3% 和 36.8%。搖瓶裝液量可能影響體積傳氧系數（kLa）進而影響搖瓶中氧的供應。通過向搖瓶中裝入不同體積的培養基，研究供氧對菌株合成BT 能力的影響。圖 5-D顯示，當 250 mL 搖瓶裝液量為 60 mL 時，BT 產量最高為 3.36 g/L，比裝液量為 50 mL 時提高了 28.7%，摩爾轉化率約為 66.5%。

圖5 培養條件對重組菌株MJ133k-ΔmtfA-PTMXM合成BT的影響Fig. 5 Effects of culture conditions on BT production of strain MJ133k-ΔmtfA-PTMXM

3 討論

3.1 CCR效應對菌株合成BT的影響

采用雙底物體系培養菌株合成 BT，不僅可以提高木糖轉化為 BT 的效率，還可以采用纖維素水解物等含有葡萄糖、木糖等多種碳源的原料作為培養基組分，對環境友好。改造菌株 CCR 效應，可以使菌株同時利用葡萄糖、木糖，進一步提高 BT 的合成效率。敲除 ptsG 基因是一種常見的改造大腸桿菌PTS 系統，克服菌株 CCR 效應的策略。在降低葡萄糖攝取速率的同時，菌株可以同時代謝木糖和葡萄糖，促進合成目標產物［21］。除 PTS 系統外，其它非PTS 系統中的蛋白也對菌株的 CCR 效應產生影響。mtfA 缺失可降低 ptsG 的表達，也降低 EIICBGlc的量，削弱 CCR 效應［22］。突變編碼磷酸葡萄糖異構酶的基因 pgi 促進了 ptsG 基因 mRNA 的降解，從而降低了葡萄糖的轉運速率［23］。我們敲除了合成 BT 的重組大腸桿菌 MJ133k-1 的 ptsG、mtfA 和 pgi 基因，進行了 BT 發酵實驗，發現了葡萄糖利用速率降低、木糖吸收速率增加的現象，表明這些基因的敲除均可以弱化菌株 CCR 效應，這導致菌株合成 BT 能力的增加。其中敲除 mtfA 比直接敲除 ptsG 基因更好的促進了 BT 合成，可能是由于直接敲除 ptsG 使菌株轉運葡萄糖的途徑有了根本的變化，對菌株代謝系統產生較大影響所致［24-25］。將上述敲除基因過表達作為對照菌株，進行 BT 發酵實驗，發現葡萄糖的消耗速率比原始菌株MJ133k-1更快，發酵結束木糖幾乎未減少，BT 產量僅有原始菌株的一半。以上結果表明弱化 CCR 效應、促進葡萄糖、木糖共利用可以有效提高菌株合成 BT 的能力。

3.2 全局抑制因子對菌株合成 BT的影響

Mlc 是一個全局抑制因子，通過干擾轉錄抑制多個與葡萄糖相關基因的表達，包括 PTS系統中的基因 ptsHI 和 ptsG［26-27］。除此之外，Hosono等［28］的研究表明 Mlc 還可以降低乙酸的積累，削弱乙酸對大腸桿菌生長的抑制。敲除 mlc 基因后一方面會解除 Mlc 對 ptsG 的抑制作用，從而強化菌株的 CCR效應，進而導致 BT 合成能力下降。另一方面，還會使胞內乙酸積累，高濃度的乙酸會抑制基因的轉錄及蛋白的合成［29］。因此 mlc 的敲除可能抑制 mtfA、pgi 的表達，減弱其對 ptsG 的阻遏作用。敲除 mlc 對菌體有兩個不同方面的影響，但 mlc 缺陷菌株 BT 產量僅有 0.19 g/L，說明 mlc 缺失會對共利用產生負面影響。在最優菌基礎上過表達 mlc 可加強 Mlc 對CCR 效應的抑制，還可降低乙酸的積累［30］，提高菌體的活性及生物量，雙重作用共同促進菌體對木糖的吸收，提高 BT 的產量，最終 BT 的產量是原始菌株的 3.2 倍，達2.61 g/L。以上結果表明敲除 mlc 對菌株在合成 BT 過程中會產生不利的影響，過表達mlc 一方面可弱化 CCR 效應，另一方面可降低乙酸積累提高菌體細胞活性，從而提高菌株合成 BT 的能力。

3.3 菌株發酵條件的優化

采用重組菌株進行產物合成不僅需要考慮菌株的生長還要考慮重組蛋白（酶）的表達和相關代謝途徑的運行。本研究中重組菌培養溫度為 33℃時BT產量最高，比大腸桿菌正常生長溫度低，可能是因為較低溫度下表達速率的降低，提高蛋白的正確折疊率［31-34］。菌株在培養基濃度為1.5×LB時表現能力最佳?？赡苁怯捎谂囵B基濃度過低時，營養物質不足而限制了菌株的生長，產物合成量也減少。而當營養物質過多時可能會導致外源蛋白表達過剩抑制菌體的生長，從而使菌體的生長代謝參數如最大比生長速率、底物最大消耗速率以及氧氣的最大傳遞效率等都會下降，最終導致目標產物產量的減少［35］。本研究發酵時的最佳裝液量為 60 mL，隨著裝液量的增加或者減少，菌株合成能力均有所下降。說明在發酵過程中溶解氧也是目標產物合成的重要影響因素。較高的溶氧濃度可促進菌體生長，降低乙酸積累，但過高會增加活性氧的量，對細胞造成不可逆的傷害，從而導致 BT 產量的減少。反之，溶氧濃度低，則限制菌體生長，并造成乙酸積累，抑制細胞生長和重組蛋白的表達［36］。

綜上所述，采用本工作所構建的最優菌株MJ133k-ΔmtfA-PTMXM，不僅提高了 BT 的產量，還減少了乙酸在胞內的積累，保證在基因缺失的條件下仍不會影響菌體的活性及生物量，在相同的發酵條件下可達到更高的 BT 產量［37］。本試驗初步研究了 CCR 效應對重組大腸桿菌合成 BT 的影響，菌株體內 CCR 效應的作用機制及更好的抑制策略還需進一步探究。

4 結論

本論文通過敲除 ptsG、mtfA、pgi 等基因構建弱化 CCR 效應的 BT 合成菌株，菌株可以同時利用葡萄糖、木糖，并促進了 BT 合成。對敲除了 mtfA 且過表達 mlc 的菌株 MJ133k-ΔmtfA-PTMXM 培養條件進行優化，得到最適發酵條件為：培養基為 1.5×LB，250 mL 搖瓶中裝入培養基 60 mL，溫度 33℃，用 10 g/L CaCO3控制發酵液 pH，BT 產量最高為 3.36 g/L，較弱化 CCR 效應前提高了 415%。