葡萄糖-木糖共利用對(duì)重組大腸桿菌合成D-1，2，4-丁三醇的影響

劉雪丹 楊萌 張靜 趙東旭

（1. 鄭州大學(xué)化工學(xué)院，鄭州 450001；2. 北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

D-1，2，4-丁三醇（BT）是含有3個(gè)羥基似甘油的 C4化合物，應(yīng)用廣泛［1］。如合成比天然橡膠更高彈性的聚氨酯發(fā)泡劑；脫水可得制抗 HIV 藥物Amprenavir 的關(guān)鍵前體—3-羥基四氫呋喃［2］，還可用作藥物緩釋劑［2-3］等。BT 最重要的應(yīng)用是合成含能材料 1，2，4-丁三醇三硝酸酯（BTTN）［4］，與硝酸甘油相比，BTTN 具有沖擊靈敏度低、熱力學(xué)穩(wěn)定性高和揮發(fā)性低等優(yōu)點(diǎn)［2］，是硝酸酯增塑聚醚推進(jìn)劑的重要組成部分［5］。

傳統(tǒng)的BT合成方法是通過(guò) NaBH4催化還原蘋果酸［3］，此方法反應(yīng)條件苛刻，副產(chǎn)物多、產(chǎn)率低、還會(huì)產(chǎn)生大量有害廢棄物［6］。Cao等［6］和Yamada-Onodera等［7］首次實(shí)現(xiàn)利用微生物合成 BT，首先由莓實(shí)假單胞菌將木糖氧化成木糖酸，然后采用重組菌株將木糖酸轉(zhuǎn)化為丁三醇。其后研究人員將用于丁三醇合成的酶全部表達(dá)到大腸桿菌中，簡(jiǎn)化了 BT合成路線［1，8-9］，如圖 1 所示。

圖1 D-木糖合成D-1，2，4-丁三醇的主要代謝途徑Fig. 1 Main metabolic pathways of D-xylose to synthesize D-1，2，4-butanetriol

丁三醇的生物合成主要以木糖為底物，在培養(yǎng)體系中加入葡萄糖形成雙底物體系，可以提高 BT合成效率［2，10］。但菌株在培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)二次生長(zhǎng)現(xiàn)象［11］，即碳代謝物阻遏效應(yīng)（CCR 效應(yīng)）［12-15］，影響了菌株對(duì)木糖的利用。馬鵬飛等［8］和Zhang等［9］構(gòu)建了缺失葡萄糖特異性滲透酶 EIIBCGlc（由ptsG 編碼）弱化 CCR 效應(yīng)的菌株，初步探討了弱化CCR 效應(yīng)對(duì) BT 合成可能產(chǎn)生的影響。除 EIIBCGlc外，其它非磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）系統(tǒng)中的蛋白也對(duì)菌株的 CCR 效應(yīng)產(chǎn)生影響。pgi（編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶）［16］和 mtfA（編碼葡萄糖-磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)輸出信號(hào)蛋白）［17］的缺失降低了 ptsG 的表達(dá)，弱化菌株的 CCR 效應(yīng)，而 mlc（編碼碳水化合物代謝的全局抑制因子）［18］的表達(dá)則會(huì)有相似的作用。有關(guān)CCR效應(yīng)對(duì)BT合成的影響還未見進(jìn)一步報(bào)道。

影響CCR效應(yīng)不同的基因具有不同功能，敲除（過(guò)表達(dá)）這些基因?qū)CR效應(yīng)影響程度不一致，對(duì)細(xì)胞代謝系統(tǒng)也會(huì)造成不同的影響。為考察不同影響CCR效應(yīng)的方式對(duì) BT 合成的影響，本論文構(gòu)建了一系列擾動(dòng) CCR 效應(yīng)的菌株，研究雙底物合成體系中葡萄糖對(duì) BT 合成的促進(jìn)作用，并對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 本實(shí)驗(yàn)所用的菌株和質(zhì)粒以及引物分別列于表 1 和表 2。

表1 本研究所用的菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids in this study

表2 本研究所用的引物Table 2 Primers in this study

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG） 購(gòu) 自Biotopped 公司，氨芐青霉素鈉和硫酸卡那霉素（kanamycin）購(gòu)自 Sigma 公司，酵母粉和蛋白胨購(gòu)自O(shè)xoid 公司，葡萄糖與氯化鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，木糖是購(gòu)自山東福藥集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 基因敲除方法 采用 Red 同源重組法［19］。本研究利用 Red 重組技術(shù)敲除了 BT 合成菌株MJ133k-1 的ptsG、pgi、mlc 和 mtfA 等4個(gè)基因，得到 了MJ134k-1、MJ133k-Δpgi-1、MJ133k-Δmlc-1、MJ133k-ΔmtfA-1 等4個(gè)菌株。

1.2.2 培養(yǎng)基與發(fā)酵條件 （1）種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法：種子培養(yǎng)采用 LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，滅菌后加入 1 mg/mL的氨芐青霉素。添加 15 g/L的瓊脂可得到 LB固體培養(yǎng)基。挑取于 -80℃ 保存的菌株在固體 LB 培養(yǎng)基上活化 2 次，培養(yǎng)溫度為 37℃。挑取單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，于 37℃、轉(zhuǎn)速 190 r/min的搖床中培養(yǎng) 14-16 h至OD6005-6 之間，用于接種發(fā)酵培養(yǎng)基。（2）發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件：發(fā)酵培養(yǎng)基：胰蛋白胨 15 g/L，酵母提取物 7.5 g/L，NaCl 15 g/L，CaCO310 g/L，滅菌后加入 1 mg/mL的氨芐青霉素。將種子培養(yǎng)基按 10% 接種量轉(zhuǎn)接至含有 50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基體積為 250 mL 的三角瓶中，6 h 后加入終濃度為 0.8 mmol/L 的 IPTG、葡萄糖 5 g/L和木糖 20 g/L，24 h時(shí)再加入葡萄糖 5 g/L。培養(yǎng)溫度 33℃，搖床轉(zhuǎn)速 190 r/min。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 檢測(cè)方法 細(xì)胞量采用濁度法測(cè)定［20］。取 2 mL 發(fā)酵液，12 000 r/min 離心 2 min，收集沉淀用1 mol/L HCl 重懸，再次用 12 000 r/min 離心 2 min，收集沉淀并用生理鹽水洗滌兩次，稀釋合適倍數(shù)。采用 UV-VI 型分光光度計(jì)（北京普析通用公司），在波長(zhǎng) 600 nm 下測(cè)量菌懸液的濁度。

葡萄糖、D-木糖、BT 等濃度的測(cè)定采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定。取 2 mL 菌液樣品，12 000 r/min 離心 2 min，取上清，用 0.22 μm 水系膜過(guò)濾后的清液進(jìn)樣。檢測(cè)設(shè)備及條件：島津LC-15C 型 HPLC，配置 RID-10A 示差折光檢測(cè)器、Aminex HPX-87H 色 譜 柱（300 mm×7.8 mm，Bio-Rad，USA）；柱溫 55℃，進(jìn)樣量 20 μL；5 mmol/L 的H2SO4為流動(dòng)相，流速 0.6 mL/min；LC solution 工作站采集及分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 弱化CCR效應(yīng)對(duì)菌株底物利用及BT合成的影響

為進(jìn)一步了解葡萄糖、木糖的共利用在 BT 合成過(guò)程中的作用，通過(guò)敲除 BT 合成菌株的 ptsG、mtfA、pgi 等基因弱化了菌株的 CCR 效應(yīng)，考察菌株培養(yǎng)時(shí)葡萄糖和木糖的利用情況，以及對(duì) BT 合成的影響。圖 2-A 表明 BT 合成菌株敲除 ptsG、mtfA、pgi 等基因后，影響了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)效率，葡萄糖利用速率下降。從圖 2-B 可以看出葡萄糖利用速率下降導(dǎo)致了 CCR 效應(yīng)的弱化，進(jìn)而使木糖利用速率顯著提高。圖 2-C表明弱化 CCR 效應(yīng)菌株合成 BT 的能力均得到提高。54 h 時(shí)，相對(duì)于對(duì)照菌株培養(yǎng)液中殘余葡萄糖為 0，敲除了 mtfA 的菌株殘余葡萄糖最多，為 1.04 g/L，但木糖消耗卻最快。mtfA 的敲除使菌株在葡萄糖較高濃度時(shí)加快木糖的吸收利用，為BT 合成提供充足的前體，BT 的產(chǎn)量也由改造前的0.81 g/L 提高到 2.21 g/L。

2.2 強(qiáng)化CCR效應(yīng)對(duì)菌株底物利用及BT合成影響

為進(jìn)一步了解CCR 效應(yīng)對(duì)重組菌株葡萄糖-木糖共利用的影響，過(guò)量表達(dá)了ptsG、mtfA、pgi等基因，考察這些基因?qū)Φ孜锢煤虰T合成的影響。由圖3-A可以看出，過(guò)表達(dá)不同基因后，不同菌株葡萄糖的消耗幾乎一致，在 30 h 和 54 h 時(shí)均無(wú)剩余。圖3-B 結(jié)果顯示，發(fā)酵結(jié)束后，不同菌株木糖剩余量均在19 g/L 左右，基本未消耗。圖 3-C 表明，過(guò)表達(dá)與共利用有關(guān)的不同基因后，BT的產(chǎn)量明顯下降，約為對(duì)照菌株MJ133k-1 BT 產(chǎn)量的50%。說(shuō)明CCR效應(yīng)不利于 BT 的合成。

圖3 強(qiáng)化CCR效應(yīng)菌株的葡萄糖、木糖利用及BT合成Fig. 3 Effect of enhancing CCR on glucose and xylose utilization and BT production by recombinant strains

2.3 全局抑制因子Mlc對(duì)菌株底物利用及BT合成影響

mlc 基因編碼的 Mlc 蛋白是一個(gè)全局抑制因子（global repressor），抑制 ptsG 的表達(dá)，有利于葡萄糖-木糖共利用。在 BT 合成菌株中敲除或過(guò)量表達(dá)該基因，以減輕或強(qiáng)化該全局抑制因子對(duì) ptsG 表達(dá)的抑制，以進(jìn)一步考察 CCR 效應(yīng)對(duì)菌株共利用葡萄糖、木糖以及對(duì) BT 合成的影響。對(duì)照?qǐng)D 2、圖 4可以看出 mlc 敲除菌株葡萄糖與木糖的利用情況與MJ133k-1 菌株基本一致，培養(yǎng) 54 h 后，葡萄糖無(wú)剩余，木糖幾乎未消耗，表明菌株沒(méi)有出現(xiàn)共利用葡萄糖、木糖的表型，與之對(duì)應(yīng) BT 的產(chǎn)量為 0.19 g/L，僅為原始菌株產(chǎn)量的 23.7%。但在敲除 mtfA 基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá) mlc 得到的菌株葡萄糖與木糖的利用情況與菌株 MJ133k-ΔmtfA-1一致，54 h后BT產(chǎn)量為2.61 g/L，與MJ133k-ΔmtfA-1相比產(chǎn)量提高了 18.1%。

圖2 弱化CCR效應(yīng)菌株的葡萄糖、木糖利用及BT合成Fig. 2 Effect of weaking CCR on glucose and xylose utilization and BT production by recombinant strains

圖4 全局抑制因子Mlc對(duì)共利用的影響Fig. 4 Effect of global repressor Mlc on co-utilization

2.4 培養(yǎng)條件對(duì)葡萄糖-木糖雙底物合成BT的影響

為進(jìn)一步提高采用雙底物合成 BT 的效率，開展了 mtfA 基因缺失、mlc 過(guò)表達(dá)的菌株 MJ133k-ΔmtfA-PTMXM 培養(yǎng)條件研究。培養(yǎng)溫度對(duì)菌株合成BT 的影響如圖 5-A所示，當(dāng)溫度為 33℃ 時(shí)，BT的產(chǎn)量達(dá)到最高為 2.61 g/L。通過(guò)在培養(yǎng)基中添加 10 g/L的 CaCO3或堿式 MgCO3，在發(fā)酵過(guò)程中維持不同的pH，研究不同 pH 對(duì)菌株產(chǎn)BT能力的影響。由圖 5-B可知，添加 CaCO3控制發(fā)酵過(guò)程中 pH 在接近中性條件下 BT 產(chǎn)量最高。

考察培養(yǎng)基濃度、裝液量這兩個(gè)參數(shù)對(duì) BT 產(chǎn)量的影響。圖 5-C表明當(dāng)培養(yǎng)基濃度為 1×LB 和2×LB 時(shí)，BT 產(chǎn)量比采用 1.5×LB 培養(yǎng)基時(shí)分別減少了 66.3% 和 36.8%。搖瓶裝液量可能影響體積傳氧系數(shù)（kLa）進(jìn)而影響搖瓶中氧的供應(yīng)。通過(guò)向搖瓶中裝入不同體積的培養(yǎng)基，研究供氧對(duì)菌株合成BT 能力的影響。圖 5-D顯示，當(dāng) 250 mL 搖瓶裝液量為 60 mL 時(shí)，BT 產(chǎn)量最高為 3.36 g/L，比裝液量為 50 mL 時(shí)提高了 28.7%，摩爾轉(zhuǎn)化率約為 66.5%。

圖5 培養(yǎng)條件對(duì)重組菌株MJ133k-ΔmtfA-PTMXM合成BT的影響Fig. 5 Effects of culture conditions on BT production of strain MJ133k-ΔmtfA-PTMXM

3 討論

3.1 CCR效應(yīng)對(duì)菌株合成BT的影響

采用雙底物體系培養(yǎng)菌株合成 BT，不僅可以提高木糖轉(zhuǎn)化為 BT 的效率，還可以采用纖維素水解物等含有葡萄糖、木糖等多種碳源的原料作為培養(yǎng)基組分，對(duì)環(huán)境友好。改造菌株 CCR 效應(yīng)，可以使菌株同時(shí)利用葡萄糖、木糖，進(jìn)一步提高 BT 的合成效率。敲除 ptsG 基因是一種常見的改造大腸桿菌PTS 系統(tǒng)，克服菌株 CCR 效應(yīng)的策略。在降低葡萄糖攝取速率的同時(shí)，菌株可以同時(shí)代謝木糖和葡萄糖，促進(jìn)合成目標(biāo)產(chǎn)物［21］。除 PTS 系統(tǒng)外，其它非PTS 系統(tǒng)中的蛋白也對(duì)菌株的 CCR 效應(yīng)產(chǎn)生影響。mtfA 缺失可降低 ptsG 的表達(dá)，也降低 EIICBGlc的量，削弱 CCR 效應(yīng)［22］。突變編碼磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的基因 pgi 促進(jìn)了 ptsG 基因 mRNA 的降解，從而降低了葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)速率［23］。我們敲除了合成 BT 的重組大腸桿菌 MJ133k-1 的 ptsG、mtfA 和 pgi 基因，進(jìn)行了 BT 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了葡萄糖利用速率降低、木糖吸收速率增加的現(xiàn)象，表明這些基因的敲除均可以弱化菌株 CCR 效應(yīng)，這導(dǎo)致菌株合成 BT 能力的增加。其中敲除 mtfA 比直接敲除 ptsG 基因更好的促進(jìn)了 BT 合成，可能是由于直接敲除 ptsG 使菌株轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的途徑有了根本的變化，對(duì)菌株代謝系統(tǒng)產(chǎn)生較大影響所致［24-25］。將上述敲除基因過(guò)表達(dá)作為對(duì)照菌株，進(jìn)行 BT 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)葡萄糖的消耗速率比原始菌株MJ133k-1更快，發(fā)酵結(jié)束木糖幾乎未減少，BT 產(chǎn)量?jī)H有原始菌株的一半。以上結(jié)果表明弱化 CCR 效應(yīng)、促進(jìn)葡萄糖、木糖共利用可以有效提高菌株合成 BT 的能力。

3.2 全局抑制因子對(duì)菌株合成 BT的影響

Mlc 是一個(gè)全局抑制因子，通過(guò)干擾轉(zhuǎn)錄抑制多個(gè)與葡萄糖相關(guān)基因的表達(dá)，包括 PTS系統(tǒng)中的基因 ptsHI 和 ptsG［26-27］。除此之外，Hosono等［28］的研究表明 Mlc 還可以降低乙酸的積累，削弱乙酸對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制。敲除 mlc 基因后一方面會(huì)解除 Mlc 對(duì) ptsG 的抑制作用，從而強(qiáng)化菌株的 CCR效應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致 BT 合成能力下降。另一方面，還會(huì)使胞內(nèi)乙酸積累，高濃度的乙酸會(huì)抑制基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白的合成［29］。因此 mlc 的敲除可能抑制 mtfA、pgi 的表達(dá)，減弱其對(duì) ptsG 的阻遏作用。敲除 mlc 對(duì)菌體有兩個(gè)不同方面的影響，但 mlc 缺陷菌株 BT 產(chǎn)量?jī)H有 0.19 g/L，說(shuō)明 mlc 缺失會(huì)對(duì)共利用產(chǎn)生負(fù)面影響。在最優(yōu)菌基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá) mlc 可加強(qiáng) Mlc 對(duì)CCR 效應(yīng)的抑制，還可降低乙酸的積累［30］，提高菌體的活性及生物量，雙重作用共同促進(jìn)菌體對(duì)木糖的吸收，提高 BT 的產(chǎn)量，最終 BT 的產(chǎn)量是原始菌株的 3.2 倍，達(dá)2.61 g/L。以上結(jié)果表明敲除 mlc 對(duì)菌株在合成 BT 過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生不利的影響，過(guò)表達(dá)mlc 一方面可弱化 CCR 效應(yīng)，另一方面可降低乙酸積累提高菌體細(xì)胞活性，從而提高菌株合成 BT 的能力。

3.3 菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

采用重組菌株進(jìn)行產(chǎn)物合成不僅需要考慮菌株的生長(zhǎng)還要考慮重組蛋白（酶）的表達(dá)和相關(guān)代謝途徑的運(yùn)行。本研究中重組菌培養(yǎng)溫度為 33℃時(shí)BT產(chǎn)量最高，比大腸桿菌正常生長(zhǎng)溫度低，可能是因?yàn)檩^低溫度下表達(dá)速率的降低，提高蛋白的正確折疊率［31-34］。菌株在培養(yǎng)基濃度為1.5×LB時(shí)表現(xiàn)能力最佳。可能是由于培養(yǎng)基濃度過(guò)低時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足而限制了菌株的生長(zhǎng)，產(chǎn)物合成量也減少。而當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)多時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致外源蛋白表達(dá)過(guò)剩抑制菌體的生長(zhǎng)，從而使菌體的生長(zhǎng)代謝參數(shù)如最大比生長(zhǎng)速率、底物最大消耗速率以及氧氣的最大傳遞效率等都會(huì)下降，最終導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的減少［35］。本研究發(fā)酵時(shí)的最佳裝液量為 60 mL，隨著裝液量的增加或者減少，菌株合成能力均有所下降。說(shuō)明在發(fā)酵過(guò)程中溶解氧也是目標(biāo)產(chǎn)物合成的重要影響因素。較高的溶氧濃度可促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，降低乙酸積累，但過(guò)高會(huì)增加活性氧的量，對(duì)細(xì)胞造成不可逆的傷害，從而導(dǎo)致 BT 產(chǎn)量的減少。反之，溶氧濃度低，則限制菌體生長(zhǎng)，并造成乙酸積累，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和重組蛋白的表達(dá)［36］。

綜上所述，采用本工作所構(gòu)建的最優(yōu)菌株MJ133k-ΔmtfA-PTMXM，不僅提高了 BT 的產(chǎn)量，還減少了乙酸在胞內(nèi)的積累，保證在基因缺失的條件下仍不會(huì)影響菌體的活性及生物量，在相同的發(fā)酵條件下可達(dá)到更高的 BT 產(chǎn)量［37］。本試驗(yàn)初步研究了 CCR 效應(yīng)對(duì)重組大腸桿菌合成 BT 的影響，菌株體內(nèi) CCR 效應(yīng)的作用機(jī)制及更好的抑制策略還需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本論文通過(guò)敲除 ptsG、mtfA、pgi 等基因構(gòu)建弱化 CCR 效應(yīng)的 BT 合成菌株，菌株可以同時(shí)利用葡萄糖、木糖，并促進(jìn)了 BT 合成。對(duì)敲除了 mtfA 且過(guò)表達(dá) mlc 的菌株 MJ133k-ΔmtfA-PTMXM 培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最適發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基為 1.5×LB，250 mL 搖瓶中裝入培養(yǎng)基 60 mL，溫度 33℃，用 10 g/L CaCO3控制發(fā)酵液 pH，BT 產(chǎn)量最高為 3.36 g/L，較弱化 CCR 效應(yīng)前提高了 415%。