脆弱擬桿菌Pif1解旋酶的表達純化與晶體生長

曹汝菲 李澤軒 許歡 張莎 張敏敏 戴楓 段曉雷，3

（1. 遵義醫科大學生物化學教研室，遵義 563000；2. 遵義醫科大學檢驗醫學院，遵義 563000；3. 西北農林科技大學生命科學學院，楊凌712100）

脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）是人類和動物腸道內厭氧菌群中的優勢菌，對于維護宿主正常生理機能至關重要［1］。當下消化道的某一部位受損或預先有病理改變時，脆弱擬桿菌會轉變為機會致病菌［2］。脆弱擬桿菌在轉化為機會致病菌時，多項解旋酶基因的表達量會發生改變，表明相關解旋酶很可能參與了機會致病過程的應激變化［3-4］。此外，不同于其他種的擬桿菌，脆弱擬桿菌機會致病菌的全基因組中G+C含量明顯偏高，而且特異GC結構相對豐富而穩定［4］，這一特征恰恰符合在氧化應激條件下G4 DNA結構易在調控區域形成的特點。這些DNA水平的異常變化，提示出特異調控G4 DNA異常形成的解旋酶很可能在脆弱擬桿菌轉變為機會致病菌過程中扮演重要角色。最新的研究表明，脆弱擬桿菌轉變成為機會致病菌的多種解旋酶（包括Pif1解旋酶）在基因組和轉錄組水平都發生了表達差異［5-6］，這些變化表明B.f Pif1解旋酶很可能在其機會致病過程中發揮著重要的調控作用。

B.f Pif1解旋酶屬于Pif1解旋酶家族成員；該蛋白家族是一類特異性解旋G4 DNA以及G-rich序列的高度保守的DNA解旋酶，其對于細胞內基因組穩定性的維持至關重要［7-8］；前人的研究已明確證實脆弱擬桿菌屬中存在此類解旋酶（B.f Pif1）［9］。近年來的大量研究表明，不同物種的解旋酶具有特異的生物學活性。例如，小鼠mPif1解旋酶失活可引起相關線粒體肌病［10］、釀酒酵母Sc.Pif1解旋dsDNA活性由于結合G4 DNA而顯著增強［11］、白色念球菌Ca.Pif1解旋酶具有特異性3'-5'核酸外切酶活性等［12］，而這些功能差異性往往是由于其結構差異性造成的。因此，科學界也開始積極關注許多物種Pif1解旋酶結構的研究：Bs.Pif1與ssDNA復合物晶體成為首個Pif1蛋白成員的蛋白結構被解析［13］，研究最廣泛的Sc.Pif1解旋酶的共結晶報道為其分子機制的研究開啟新篇章［14］，而人類hPif1解旋酶更是“十年磨一劍”終于在2019年得以發表其晶體結構信息［15］。但是，迄今為止，有關B.f Pif1解旋酶的蛋白結構與功能的研究仍處于空白階段。

本研究通過對B.f Pif1解旋酶進行原核表達與純化，獲得高純度、高濃度的B.f Pif1蛋白；再利用多種結晶試劑盒進行結晶篩選及晶體生長條件優化，并進行該蛋白晶體的初步X射線衍射，為下一步的晶體衍射優化、B.f Pif1蛋白結構解析及功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、引物與質粒 Bacteroides fragilis菌株購自于ATCC；前期同源序列比對與預試驗中可溶性分析等明確B.f Pif1解旋酶的全長序列（NCBI Sequence ID：WP_005787496.1，833Aa）中 的21-402 aa為解旋酶核心結構域，可進行晶體結構研究，目的基因B.f Pif1核心結構域上游引物：5'-GGAATT CCATATGCTTTTTCTGACAGGAAAGGCC-3'，下游引物：5'-CCGCTCGAGCTTACAACGACTCAGAGCGAC AT-3'，由上海生工生物工程有限公司合成。大腸桿菌DH5α菌株、表達載體pET15b-SUMO，以及E.coli BL21（DE3）菌株均購自大連寶生物公司。

1.1.2 試劑 SUMO蛋白酶由遵義醫科大學檢驗醫學院段曉雷課題組自行制備。RNA提取與逆轉錄試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司。高保 真DNA聚 合 酶PrimerSTAR、T4 DNA連 接 酶、Nde I、BamH I、Xho I等限制性內切酶均購自大連寶生工生物工程有限公司。鎳-親和層析柱（Ni-NTA）、Superdex 200（S200）凝膠過濾層析柱、DEAE陰離子交換柱、PD MiniTrap G-25預裝脫鹽柱以及超濾離心管均購自美國GE公司。質粒抽提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自康為公司。Salt RxTMI、IndexTM、Cystal screen I和Cystal screen II、PEG I和PEG II結晶篩選試劑盒購自美國Hampton Research公司。

1.2 方法

1.2.1 B.f Pif1解旋酶的原核表達載體構建 提取脆弱擬桿菌總RNA，并反轉錄獲得cDNA，以其為模板，使用靶標基因特異性引物，參照PrimerSTAR標準體系進行PCR擴增，反應程序為98℃ 10 s，58.5℃ 15 s，72℃ 1 min 15 s（34 cycles）。PCR產物經Nde I/EcoRI雙酶切，由T4酶連接后構成pET15b-SUMO-B.f Pif1重組表達載體，轉入DH5α，涂布于LB/Amp（100 μg/mL）平板，篩選陽性克隆菌株，挑取陽性菌株擴大培養并提取質粒，再進行雙酶切鑒定；同時將重組質粒送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序鑒定。

1.2.2 B.f Pif1重組蛋白的誘導表達 將鑒定成功的pET15b-SUMO-B.f Pif1重組質粒轉入表達菌株E.coli BL21（DE3）感受態細胞，涂布于LB/Amp（50 μg/mL）平板，挑取單克隆菌株再接種至5 mL LB/Amp（50 μg/mL）液體培養基進行活化；按1∶1 000比例轉接至3 L液體LB培養基內，以37℃ 200 r/min培養至菌液OD600為0.5左右，按1∶1 000比例加入不同濃度的IPTG（0.1、0.3、0.5與0.8 mmol/L）進行誘導，并在不同誘導溫度（37℃誘導表達4 h、28℃誘導表達8 h、18℃誘導表達16 h）下誘導目的蛋白（B.f Pif1）的表達。

1.2.4 SUMO酶切與第二次Ni-NTA親和層析 將第一次Ni-NTA純化產物進行SUMO蛋白酶酶切，按SUMO酶與待純化蛋白1∶100的質量比加入，4℃透析過夜。次日，將酶切與透析后的蛋白溶液再次流經鎳柱純化，并用鎳柱洗脫液洗脫帶His-Tag的雜蛋白和SUMO酶，并收集Ni-NTA流出液及平衡液進行10% SDS-PAGE檢測。

1.2.5 DEAE陰離子交換柱層析 將上一步純化產物（蛋白溶液）快速（15 mL/min）流經脫鹽預裝柱，以置換buffer為離子交換柱平衡緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl pH 7.2、100 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT、1 mmol/L EDTA和10%甘油）。將脫鹽后蛋白溶液上樣至預平衡的DEAE陰離子交換柱內，以1.5 mL/min流速、按NaCl濃度線性梯度（l00-1 000 mmol/L）進行蛋白洗脫——利用AKTA prime plus色譜系統監測離子交換層析中的蛋白吸收峰變化，分部收集洗脫峰對應的蛋白溶液，并進行SDS-PAGE檢測。

1.2.6 Supdex 200凝膠過濾層析（分子篩） 預先用分子篩平衡緩沖液（20 mmol/L Tris pH 7.5、300 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT和1 mmol/L EDTA）平衡S200分子篩，隨后依據分子量大小分離純化蛋白：將蛋白樣品濃縮到1 mL上樣，用一個柱體積（約130 mL）的分子篩平衡緩沖液洗脫（流速為0.5 mL/min，壓強上限0.4 MPa），并結合紫外吸收峰收集目的蛋白。最后用SDS-PAGE相關的灰度分析法檢測蛋白純度，并用Bradford法測定蛋白濃度。

1.2.7 驗證純化蛋白的活性 B.f Pif1重組蛋白的最終純化產物需超濾濃縮后，加入20%終濃度甘油，液氮速凍后置于-80℃保存備用。利用Stopped-flow設備對純化好的B.f Pif1蛋白進行解旋酶活性與解旋極性檢測［16-17］，以驗證B.f Pif1解旋酶活性。

1.2.8 B.f Pif1蛋白結晶初篩與晶體生長條件優化

采用Salt RxTMI、IndexTM、Cystal screen I和Cystal screen II、PEG I和PEG II等多種結晶初篩試劑盒對低溫高速離心后的B.f Pif1蛋白進行晶體初步篩選；初篩條件是：晶體生長池中含1 μL上述結晶篩選試劑盒中的成分液與1 μL B.f Pif1蛋白，平衡池則為98 μL試劑，結晶機器人反應室內溫度設定為4℃和20℃。該機器人主要利用棋盤法原理進行條件優化，主要包括蛋白質濃度、pH緩沖液、沉淀劑/添加劑種類、濃度及組合等。

1.2.9 B.f Pif1蛋白晶體的初步X射線衍射 對初篩優化后狀態良好若干B.f Pif1蛋白晶體進行持續培養：此時晶體生長采用座滴氣相擴散法；再將逐步分散培養的晶體置于16℃晶體培養箱，每天于顯微鏡下觀察記錄晶體生長狀況。待培養2周左右，挑取靶標蛋白晶體，放置于MAR 345DTB X-ray衍射儀的衍射套環上，進行X射線衍射并收集衍射數據，并將衍射后的蛋白晶體經SDS-PAGE檢測再次明確其為B.f Pif1蛋白。初步X-ray衍射數據較好的蛋白晶體采用液氮保存，后續送上海光源同步輻射進一步研究。

2 結果

2.1 目的基因的擴增及原核表達載體的構建

根據表達載體pET15b-SUMO-B.f Pif1示意圖（圖1-A）進行載體構建，并通過菌落PCR與重組質粒EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切進行鑒定，結果（圖1-B）顯示，PCR與酶切產物大小均約為1 200 bp，與靶標基因序列（1 146 bp+酶切位點與保護堿基）預期相符。此外，重組質粒測序結果與B.f Pif1解旋酶的靶標序列完全一致，表明表達載體構建成功。

“風雨說”以黃進為首提出的，他們認為廣東丹霞地貌及北國山山頂的上凹坑形成主要是由風化、雨水的滴蝕、溶蝕作用下產生的，稱之為“風化、雨滴溶蝕說”，簡稱“風雨說”。

圖1 表達載體pET15b-SUMO-B.f Pif1的構建Fig. 1 Construction of expression vector pET15b-SUMOB.f Pif1

2.2 B.f Pif1重組蛋白的誘導表達

經過誘導條件（主要是不同IPTG濃度與不同誘導溫度）的優化（圖2），該重組蛋白的最佳IPTG工作濃度為0.5 mmol/L，最適誘導溫度為18℃（180 r/min）誘導16 h。超聲破碎后，SDS-PAGE檢測分離蛋白的上清液與沉淀，結果顯示（圖2，圖3-A），均有一條大小約為70 kD的誘導蛋白，并與期望結果大小相符（B.f Pif1蛋白+His-Tag+SUMO His-Tag），該目的蛋白可溶性良好。再與Ni-NTA親和層析柱結合后，穿出液明顯下降（圖3-A），說明目標蛋白結合鎳柱效果優良。

圖2 不同IPTG濃度與不同誘導溫度誘導B.f Pif1蛋白的表達Fig. 2 Expression of B.f Pif1 protein induced with different IPTG concentrations and different induction temperatures

2.3 鎳柱純化與SUMO酶切

待蛋白上清液流經鎳柱后，用含有不同咪唑濃度的洗脫液將融合蛋白從鎳柱上洗脫，接收各個洗脫液組分，SDS-PAGE檢測結果（圖3-B）顯示，在300 mmol/L咪唑濃度條件下，重組蛋白被大量洗脫下來（盡管含有部分雜蛋白條帶）。SUMO酶切前后的電泳結果（圖3-C）顯示，融合蛋白解體、目的蛋白與SUMO-Tag等蛋白標簽分離。再經第二次鎳柱純化，SDS-PAGE檢測純化結果（圖3-D）說明SUMO及His標簽已被留在鎳柱上；而無標簽的目的蛋白在Ni-NTA穿出液內，條帶約為45 kD，與理論值相符。

圖3 B.f Pif1蛋白的誘導表達、鎳柱純化與SUMO酶切Fig. 3 Induced expression，Ni-NTA purification and SUMO digestion of B.f Pif1 protein

2.4 經DEAE陰離子交換柱層析的純化

使用DEAE陰離子交換柱對經第二次鎳柱洗脫后的蛋白溶液進一步純化，利用AKTA自帶程序監測層析過程中蛋白紫外吸收圖譜，準確收集洗脫液（圖4-A），結果表明，隨著NaCl濃度的梯度增加，B.f Pif1蛋白經過DEAE陰離子交換柱出現了2個特異蛋白吸收峰；對應的SDS-PAGE結果則顯示吸收峰A內的目的蛋白更純，而且濃度較大，經過本步驟純化，蛋白純度得到進一步提高至85%，但仍有少量雜蛋白存在。

圖4 B.f Pif1蛋白的DEAE離子交換層析與S200分子篩純化Fig. 4 Purifications of B.f Pif1 protein by DEAE ion-exchange chromatography and S200 gel filtration chromatography

2.5 B.f Pif1重組蛋白的凝膠過濾層析

利用蛋白質分子量的差異，將上一步純化后的蛋白溶液通過凝膠過濾層析柱superdex200（GE Healthcare）作進一步純化，并去除蛋白多聚體（以利于蛋白結晶的出現）。結果顯示（圖4-B），若在過分子篩之前加入3 mmol/L DTT處理2 h，再經過S200凝膠過濾層析純化，B.f Pif1單體狀態成為其主要成分，而二聚體含量極低，表明純化過程中可能產生的B.f Pif1二聚體等被DTT還原其二硫鍵所抑制。最終純化產物經10%SDS-PAGE檢測與灰度分析，目的蛋白純度達98.5%（圖4-C）；蛋白超濾濃縮后，經BCA法測得濃度為17 mg/mL，達到預期要求，有利于后續晶體的生成。

2.6 B.f Pif1蛋白的生物學活性驗證

若想了解B.f Pif1解旋酶的蛋白晶體結構，必須保證表達純化后的目的蛋白具有良好的生物學活性，即揭示其蛋白結構必須為其天然構象。利用Stopped-flow FRET檢測技術驗證純化所得B.f Pif1蛋白是具有活性的解旋酶（圖5-A），純化后的B.f Pif1蛋白可利用ATP解旋dsDNA與含G4 DNA的底物（熒光信號顯著增加）；而且還發現B.f Pif1解旋含G4 DNA的活性明顯優于解旋dsDNA。此外，還驗證了B.f Pif1蛋白的解旋極性（圖5-B），B.f Pif1解旋5'-ssDNA-G4-dsDNA時熒光信號增加，而與3'-ssDNA-G4-dsDNA反應則幾乎無熒光信號變化，表明該蛋白具有Pif1家族解旋酶特異的5'-3'解旋方向性。

圖5 純化后B.f Pif1蛋白具有良好的生物學活性Fig. 5 Purified B.f Pif1 protein showing good biological activity

2.7 B.f Pif1蛋白結晶初篩與結晶條件優化

利用多種蛋白結晶試劑盒對B.f Pif1蛋白晶體進行初篩，結果發現在多個條件下出現微晶；繼續培養后這些晶體逐漸生長（圖6-A和6-B），1周后其寬度為12-20 μm，長度為110-190 μm，呈細長棒狀的孿晶形態；同時使用蛋白結晶專用檢測的UY200型顯微鏡鑒定（圖6-C），明確這些結晶為蛋白質晶體，只有蛋白晶體才會在280 nm紫外光下特異顯示（圖6-C為圖6-B在紫外顯微鏡下的成像）。隨后在已篩選培養出蛋白晶體的基礎上，大量優化晶體培養條件后（尤其是改變沉淀劑濃度與稀釋蛋白濃度），蛋白孿晶聚集現象逐漸減少（圖7-A）；又更換蛋白結晶點樣方式為座滴氣相擴散法，在蛋白結晶微滴的邊緣處出現了單個的蛋白晶體，不同條件下呈現規則的長方體或立方體晶體（圖7-B）。

圖6 結晶試劑盒初篩得到B.f Pif1晶體Fig. 6 Protein crystals of B.f Pif1 preliminarily screened with different crystallization kits

圖7 B.f Pif1蛋白晶體培養條件的優化Fig. 7 Optimization of the culture conditions for B.f Pif1 protein crystals

2.8 B.f Pif1蛋白晶體生長變化與X射線衍射初步結果

在多種蛋白結晶條件優化后，逐步確定了最 佳 結 晶 條 件：9 mg/mL B.f Pif1、100 mmol/L NH4Acetate、16% PEG4000 pH 6.5以 及0.1 mol/L Bis-Tris乙酸（pH 8.3）、0.05 mol/L碳酸氫鈉、5%甘油和0.015 mol/L亞精胺或0.002 mol/L PEG2000等。不同條件長出的晶體形態有所差異，但都為形態良好的單晶；并且較長時間觀察這些條件下晶體生長與形態變化（圖8），其中蛋白晶體最長生長時間是19 d，此后蛋白晶體不再長大，形態規則的長方形晶體；但13 d之后，中心區域晶體出現孿晶現象——因此，后續挑去邊緣的單晶獨立培養。經多個最佳晶體生長條件下獨立培養的蛋白晶體使用德國布魯克AXS公司CCD單晶X衍射儀進行衍射試驗（圖9-A、圖9-B-a和圖9-B-b）；其中，最好的衍射分辨率達到3.5 ?（圖9-B-c）。隨后對衍射良好蛋白晶體溶解后再進行SDS-PAGE電泳驗證，結果顯示，該蛋白晶體分子量為45 kD左右，證明這些具有良好衍射特征的蛋白晶體就是B.f Pif1解旋酶蛋白。

圖8 B.f Pif1蛋白晶體生長情況Fig. 8 Growths of B.f Pif1 protein crystals

圖9 不同條件下B.f Pif1蛋白單晶的X射線衍射圖譜及其對應蛋白電泳Fig. 9 X-ray diffraction patterns of B.f pif1 protein single crystal under different conditions and its corresponding SDS-PAGE

3 討論

近年來，在脆弱擬桿菌機會致病性研究中其分子機制成為熱點［18-19］，但此類研究往往關注脆弱擬桿菌病變中某種信號通路改變而激活個別轉錄因子所產生的致病效應，并未深入探討其致病時應激變化可導致相關差異基因轉錄水平或轉錄后水平調控的原因。但迄今為止，可高效特異解旋G4 DNA從而維持基因組穩定性的脆弱擬桿菌Pif1解旋酶（B.f Pif1）的結構與功能的研究都未見報道。因此，本研究針對B.f Pif1表達純化與結晶的研究是首次較為深入地探討該方向的相關研究。

蛋白質三維結構的深入研究，需要首先獲得高純度（純度＞97%）與高濃度（一般高于10 mg/mL）的B.f Pif1蛋白［20］。在優化目的蛋白最佳誘導條件表達后，本研究設計了一系列的蛋白純化方案，其中SUMO酶切結合Ni-NTA親和層析最為關鍵。借鑒Marblestone等［21］關于SUMO表達體系應用的報道，本研究選用SUMO工具酶以利用其以下優勢：（1）該融合標簽不僅促進蛋白的可溶性，而且還具有分子伴侶功能，能幫助目的蛋白構象的正確折疊［22］；（2）其分子量較小，相比于TEV 蛋白酶更加高效，這一點是在之前類似研究基礎上的優化與改進；（3）使用本實驗室自行純化并在前期研究中已經驗證活性的SUMO蛋白酶［23］，在簡化純化需求的同時，成功將蛋白純度從85%提升至95%；（4）采用SUMO表達體系，經過第二次鎳柱純化后，能夠最大限度去除原有的SUMO-Tag及N端的His-Tag標簽，不含任何標簽的蛋白質本身更容易結晶，并且所結晶體更接近天然構象狀態［24］。經過第一步親和層析后，利用B.f Pif1蛋白pI＜7的生化特征，選擇DEAE弱陰離子交換層析進行蛋白的分離純化；但結果中仍有少量的雜蛋白。再借鑒清華大學李海濤課題組相關研究中的純化思路［25］，選取Superdex 200凝膠過濾層析純化，為有利于蛋白單晶的形成，選用3 mmol/L DTT破壞二硫鍵以優化蛋白聚集狀態，這與此前BsPif1晶體結構研究中結晶前處理相一致［13］。

本研究要進行蛋白結晶與晶體結構分析，還需驗證表達純化產物是具有活性驗證，結果顯示純化后的B.f Pif1蛋白具有良好的解旋活性，并且解旋含G4 DNA底物的活性更強，這一點跟前人報道多種Pif1解旋酶的特征相符［11，26］；同時還驗證出該解旋酶具有Pif1解旋酶家族特異5'-3'解旋極性，揭示本研究獲得B.f Pif1解旋酶蛋白具有其天然構象，適于后續蛋白質結構與功能的研究。

不同蛋白的結晶條件千差萬別，往往與結晶方法及所需結晶蛋白的純度、特性、緩沖液等因素相關［27］。本研究中B.f Pif1蛋白結晶進行了大量的篩選，有至少6個初始晶體條件可以篩選出晶型較好、生長穩定重復性好的B.f Pif1蛋白晶體（紫外顯微鏡與蛋白電泳均證實）；在此基礎上優化培養晶體，調整沉淀劑濃度與稀釋蛋白質濃度以及采用16℃的座滴法，此類優化方法與前人研究類似［14］；最終所獲蛋白單晶使用X-ray初步衍射其衍射點最高分辨率達到3.5 ?，提示本研究條件下的最佳B.fPif1蛋白單晶生長條件為0.1 mol/L Bis-Tris乙酸（pH 8.3）、0.05 mol/L碳酸氫鈉、5%甘油和0.015 mol/L亞精胺。對比分析本研究與其他Pif1解旋酶家族成員的結晶條件［13，15］：不同Pif1解旋酶家族成員（無論是單蛋白晶體還是蛋白復合物共結晶）的結晶條件都各不相同；即使同一Pif1蛋白的高分辨率結晶條件也可以存在多個。待后續B.f Pif1晶體送上海光源高能衍射后為獲得更高分辨率，結晶條件可能被進一步優化；隨后的硒代培養蛋白的結晶或B.f Pif1與G-rich的ssDNA共結晶晶體的優化條件也必然需要進一步探討。

盡管西北農林科技大學奚緒光課題組前期曾成功對Bs.Pif1解旋酶蛋白進行晶體研究［26］，表明該蛋白是Pif1解旋酶家族中首次被成功結晶與解析的蛋白質；但是本研究所結晶的B.f Pif1與BsPif1在序列與功能上存在一些明顯的差異性。首先，同源序列比對與系統進化樹分析表明兩者間所具有序列保守性，但也存在氨基酸一級序列明顯差異位點與區段（數據未給出），這主要源于2種細菌不同生長環境所需維持不同基因組穩定性的Pif1解旋酶進化過程中的差異性［4，23］。其次，功能上差異則主要根據其生理生化特征不同：BsPif1是普通擬桿菌內的一種Pif1解旋酶，其臨床意義不大；而本研究探索的B.f Pif1則是與人類腸道菌群中占據優勢的脆弱擬桿菌［28］以及其變為機會致病菌［2］的過程中所形成G-rich序列特異調控相關的Pif1解旋酶，曾有報道指出機會致病的脆弱擬桿菌基因組內存在G+C含量異常升高與特異基因表達調控區DNA結構異常變化［4-5］，提示在機會致病過程中必然存在高效解旋G-rich序列的解旋酶以維持基因組穩定性。因此，深入研究B.f Pif1解旋酶的結構與功能將為消化道疾病病變患者體內脆弱擬桿菌機會致病過程提供新的研究與診療視角，這正是研究本蛋白結晶的意義所在。

在本研究成功表達純化B.f Pif1重組蛋白、經過多種結晶初篩與條件優化及初步衍射而獲得了質量較好蛋白單晶的基礎上，后續研究主要將衍射較好的晶體送上海光源進行高能量X-ray衍射，硒代培養基發酵B.f Pif1的純化與結晶、衍射，以獲得足夠的衍射數據與相位信息進行B.f Pif1蛋白的晶體結構解析；同時還將研究B.f Pif1與特異GC序列DNA共結晶體的結構，為分析B.f Pif1解旋酶的關鍵氨基酸作用位點及潛在的治療藥物靶向結合等奠定前期基礎，為脆弱擬桿菌機會致病病變提供新的診斷分子靶點和精準治療路徑。

4 結論

成功將B.f Pif1解旋酶進行原核誘導表達與一系列層析純化，獲得具有純度高（＞98.5%）、濃度大（17 mg/mL）、活性強的B.f Pif1蛋白；并利用結晶機器人及棋盤法對結晶條件進行篩選與優化，明確9 mg/mL B.fPif蛋白可在最優的結晶條件為0.1 mol/L Bis-Tris乙酸（pH 8.3）、0.05 mol/L碳酸氫鈉、5%甘油和0.015 mol/L亞精胺下生長出較好質量的晶體，其初步X-ray衍射的分辨率可達3.5 ?。