新疆荒漠肉蓯蓉粗多糖對口蹄疫疫苗抗體和T細胞亞群的影響

張愛蓮 巴雪麗 王丹陽 趙兵

（新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源與基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

口蹄疫（foot and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）引起的一種在偶蹄類動物之間傳播的疾病，嚴重危害家畜健康，造成巨大經濟損失。疫苗接種作為預防口蹄疫的有效手段被廣泛使用，并取得顯著成效。由于口蹄疫病毒滅活抗原免疫原性較弱，往往需要添加佐劑才能發揮作用［1-2］。目前，商品化口蹄疫疫苗中常用佐劑是ISA-206油乳劑，它是Thl細胞的激活劑，也能增強體液免疫應答，但其副作用較大。盡管佐劑種類繁多，如常用佐劑（鋁鹽類佐劑，油水乳劑等）和新型佐劑（MF59，植物多糖等），但是用于口蹄疫疫苗的佐劑仍然有限，主要包括氫氧化鋁、司班、輕型礦物油等，均存在不同的缺陷，如免疫效果不理想或毒副作用大等［3-4］。因此，急需研制高效、低毒的口蹄疫疫苗新型佐劑，用于提高疫苗的免疫保護效果，這對于口蹄疫的防治具有積極意義。

中草藥在傳染病防治中具有廣泛的應用前景，中草藥治療人類和動物疾病有著悠久的歷史。在疫苗佐劑研究領域，國內外研究者已經從多種中草藥中提取多糖成分研究其佐劑效果，如人參多糖、黃芪多糖、茯苓多糖、淫羊藿多糖等，發現其對人類和動物免疫機能有很好的促進作用而成為新型的候選佐劑［5-7］。新疆荒漠肉蓯蓉（Cistanche deserticola Y.C.Ma）為列當科植物，是常用的益補類中草藥，一直用作滋補食品被人們長期食用。近些年，研究者們主要針對荒漠肉蓯蓉多糖的化學結構和藥理活性方面開展了大量的研究工作，發現其有效成分主要包括多糖、苯乙醇苷類化合物、生物堿等，其中多糖含量較高，可以調節免疫系統，具有抗氧化、抗衰老等作用［8-9］。前期研究發現荒漠肉蓯蓉粗多糖聯合OVA免疫小鼠后顯著增強了OVA特異性抗體水平，與流感疫苗配伍可以提高流感疫苗的抗體水平［10-11］。鑒于此，本研究以荒漠肉蓯蓉粗多糖作為口蹄疫滅活疫苗的候選佐劑，篩選具有顯著免疫增強效果、副反應小的水溶佐劑，使荒漠肉蓯蓉粗多糖可以有效的應用于口蹄疫疫苗新型佐劑的研制。

本研究以荒漠肉蓯蓉粗多糖（Cistanche deserticola crude polysaccharide，CDCP）配伍FMDVAg制備疫苗，肌肉途徑免疫ICR小鼠，通過檢測免疫后對小鼠體液免疫和細胞免疫反應的影響，并觀察其安全性，為高效、安全的口蹄疫疫苗新型佐劑的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF雌性ICR小鼠（20-25 g）購買于新疆醫科大學實驗動物中心（合格證號SCXK（新）2016-0003），小鼠喂養5 d后進行動物免疫實驗。動物實驗在新疆生物資源基因工程重點實驗室動物房內進行。實驗獲得新疆大學新疆生物資源基因工程重點實驗室動物實驗倫理委員會批準，動物倫理批件編號為： BRGE-AE001。

1.1.2 實驗材料及試劑 CDCP為實驗室制備（多糖含量為60%）［10］，用0.9% NaCl溶解，配制粗多糖母液濃度為20 mg/mL的溶液，過濾除菌備用。FMDV-Ag，ISA-206油佐劑來自天康生物股份有限公司。RPMI-1640培養基和胎牛血清為Hyclone公司產品。山羊抗鼠的辣根過氧化物酶標記IgG-HRP購自Southbiotech公司；刀豆蛋白A（ConA）、脂多糖（LPS）和N-四甲基聯苯胺（TMB）購自Sigma公司；噻唑藍（MTT）購自Amresco公司。流式檢測用抗體PECD3、APC-CD4、APC-CD8、FITC-CD8、PE-CD44購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及免疫 將CDCP溶液、FMDV-Ag、ISA-206油佐劑按照一定的比例混勻，制備成疫苗。雌性ICR小鼠隨機分為4組，每組6只，具體分組如下：0.9% NaCl對照組、FMDV-Ag組（146S，0.3 μg/每只小鼠，無佐劑）、FMDV-Ag/CDCP組（146S，0.3 μg/每只小鼠，CDCP 400 μg）、FMDV/ISA-206組（146S，0.3 μg/每只小鼠，ISA-206油佐劑）。肌肉免疫，100 μL/只，于0 d初次免疫和14 d加強免疫。采用同樣的免疫策略免疫小鼠后進行淋巴細胞增殖實驗，T細胞亞群檢測實驗。

1.2.2 IgG抗體水平檢測 在初免后14 d、21 d、28 d小鼠眼眶采血制備血清，間接酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測抗體水平。方法參考文獻［12］，簡述如下：包被合適濃度的FMDV-Ag到96孔板中，4℃放置12 h。加入5%脫脂奶粉封閉1 h。接著，加入稀釋的小鼠免疫后血清，37℃ 孵育1 h。加入稀釋的IgGHPR抗體，37℃孵育1 h。加入TMB 底物溶液，顯色15-20 min，加入H2SO4溶液終止，酶標儀上檢測OD450的值。

1.2.3 脾臟淋巴細胞增殖檢測 加強免疫后7 d，制備脾臟單細胞懸液，裂解紅細胞，洗滌并離心收集細胞。將細胞計數后，調整濃度為2×106/mL的單細胞懸液加入到細胞培養板中，設置3個復孔，再分別加入合適濃度的FMDV-Ag、ConA、LPS刺激細胞，37℃放置48 h，加入MTT繼續培養3-4 h后，棄上清，加入DMSO溶解沉淀，在酶標儀檢測OD490的值。計算每組刺激指數（SI）：SI=（OD各刺激孔-OD培養基）/（OD未刺激孔- OD培養基）。

1.2.4 T細胞亞群檢測 流式細胞術進行表面染色，檢測免疫后小鼠脾臟T細胞亞群的表達水平。如上1.2.3所述制備脾單細胞懸液，調整細胞濃度為1×106/mL，用含0.5% 胎牛血清的磷酸緩沖液洗滌細胞，離心后棄上清。細胞分別用流式抗體PECD3、APC-CD4、APC-CD8、FITC-CD8、PE-CD44進行避光染色30 min，加入含0.5%胎牛血清的磷酸緩沖液終止染色，離心棄上清加入300 μL磷酸緩沖液混勻細胞，上機檢測。

1.2.5 統計分析 實驗數據以平均值±標準差表示，運用FlowJo 7.6處理流式細胞術檢測結果，Graph Pad Prism 5.0進行數據統計學分析。不同實驗組數據用one-way ANOVA分析后，運用Tukey’s Multiple-Comparison Test分析不同組數據之間的差異性，“*”表示兩組數據之間差異顯著（P＜0.05），“**”表示兩組數據之間差異極顯著（P＜0.01）。

2 結果

2.1 CDCP對血清中FMDV特異性抗體水平的影響

初疫后14 d、21 d、28 d血清IgG的水平呈現逐漸增強的趨勢（圖1）。初免后14 d和21 d，FMDVAg/CDCP組抗體水平顯著高于FMDV-Ag無佐劑組（P＜0.05），與FMDV組無顯著差異（P＞0.05）。初免后28 d，與FMDV-Ag無佐劑相比，FMDV-Ag/CDCP的IgG抗體水平顯著提高（P＜0.05），但是極顯著低于FMDV/ISA-206組（P＜0.01）。FMDV-Ag無佐劑組的抗體水平與0.9% NaCl對照組顯著差異（P＜0.05）。

圖1 間接ELISA檢測血清中FMDV特異性抗體水平Fig.1 Detection on FMDV-specific antibody by indirect ELISA

2.2 CDCP對脾臟淋巴細胞的增殖作用

初免后21 d，MTT法檢測CDCP對脾淋巴細胞的增殖作用。如圖2所示，FMDV-Ag體外刺激脾淋巴細胞后，FMDV-Ag/CDCP組的淋巴細胞刺激指數顯著高于FMDV-Ag無佐劑組（P＜0.05），且與FMDV/ISA-206組無顯著差異（P＞0.05）。ConA、LPS刺激后，可顯著增強脾臟淋巴細胞增殖（P＜0.05）。

圖2 CDCP對淋巴細胞增殖的影響Fig. 2 Effect of CDCP on splenocyte proliferation

2.3 CDCP對CD4+和CD8+ T細胞表達的影響

初免后21 d，檢測CDCP配伍FMDV-Ag對小鼠脾臟中CD4+和CD8+T細胞的影響。結果如圖3-AD，FMDV-Ag/CDCP組CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞亞群的比例顯著高于FMDV-Ag無佐劑組（P＜0.05），且與FMDV/ISA-206組之間差異不顯著（P＞0.05）。FMDV-Ag無佐劑組沒有增強CD4+和CD8+T細胞表達。

圖3 CDCP對CD4+和CD8+ T細胞亞群的影響Fig.3 Effects of CDCP on CD4+ and CD8+ T cell subsets

2.4 CDCP對CD4+CD44+和CD8+CD44+效應T細胞亞群的影響

為觀察CDCP對效應T細胞的影響，流式細胞術檢測免疫后小鼠脾臟細胞中CD4+CD44+和CD8+CD44+的表達情況。結果如圖4-A-D，FMDVAg/CDCP組CD4+CD44+和CD8+CD44+的 百 分 比 顯著高于FMDV-Ag無佐劑組（P＜0.05），且與FMDV/ISA-206組之間差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 CDCP對CD4+ CD44+、CD8+ CD44+效應T細胞的影響Fig.4 Effects of CDCP on CD4+ CD44+ and CD8+ CD44+ effector T cell

2.5 CDCP對小鼠生長的影響

CDCP通過肌肉途徑免疫動物后，整個免疫期間觀察小鼠生長情況并每周稱量體重，觀察注射部位肉芽腫情況（表1）。免疫后小鼠沒有脫毛、拒食等現象，免疫后14 d、21 d、28 d每組小鼠體重正常增長，各組間體重沒有顯著變化（P＞0.05）。FMDVAg/CDCP組小鼠注射部位未見肉芽腫，含有ISA 206油佐劑的FMDV疫苗組小鼠注射部位有肉芽腫。

表1 FMDV/CDCP免疫后小鼠體重變化Table 1 Changes in body weight of mice immunized with FMDV/CDCP

3 討論

佐劑長期以來用于各類疫苗中，可以輔佐疫苗發揮免疫促進作用，降低疫苗用量，對于傳染病的防治和流行起到了非常重要的作用［3］。隨著新型疫苗的發展，不論是獸用疫苗研究領域還是人用疫苗研究領域，對疫苗佐劑數量上和質量上的要求越來越高了。理想的新型佐劑應該是對機體的細胞或體液免疫均有有效的激發作用、作用持久穩定、免疫次數減少、副作用小，同時便于生產和易于注射［13］。在FMDV滅活疫苗中，通常通過添加油佐劑發揮疫苗的免疫增強作用，但是存在免疫應激大等缺點。水佐劑與油佐劑相比使用簡單，可以與疫苗抗原以任意比例互溶，無須乳化，容易注射，因此水佐劑在FMDV疫苗中具有良好的應用前景。

中草藥多糖有良好免疫調節作用，加之其在安全性、多效性、無依賴性等方面的優勢，成為新型疫苗佐劑研究的一個熱點［14］。在FMDV疫苗佐劑研究領域，一些中草藥多糖被用于新型佐劑的研究中，如黃芪多糖作為FMDV疫苗的佐劑，通過口服途徑免疫能夠增強體液和細胞免疫，低劑量抑制樹突狀細胞的成熟，高劑量可以促進其成熟。研究者們也用白術多糖、杜仲多糖作為FMDV疫苗的佐劑探討了其免疫增強的作用［15-17］。由于不同中草藥的活性成分含量有很大的差別，從具有免疫活性的中草藥中進行廣泛篩選，尋找合適的佐劑對于疾病防治和人類健康意義重大，也是疫苗學領域中的研究熱點。

本實驗選用CDCP作為FMDV疫苗的候選佐劑，進行了佐劑效應的實驗研究。傳染病的防治主要依賴B淋巴細胞介導的體液免疫反應和T淋巴細胞介導的細胞免疫反應［18-20］。由于FMDV疫苗在生產實際采用的是肌肉免疫方式，為此，在實驗中選用肌肉途徑免疫小鼠，通過評價CDCP對抗體產生和T細胞亞群的影響來評價其免疫增強作用，并進行安全性的初步觀察。研究結果表明，免疫后14 d和21 d，肉蓯蓉粗多糖可以增強FMDV特異性的抗體水平，且作用和ISA-206佐劑水平沒有顯著差異；在免疫后28 d的抗體水平低于ISA-206油佐劑，這說明CDCP在免疫后的一定時間內可以增強體液免疫水平。淋巴細胞增殖率與刺激指數的高低呈正相關，在MTT實驗中，CDCP可促進FMDV抗原、ConA和LPS刺激的淋巴細胞增殖。在T細胞亞群實驗中，CDCP不僅可以提高CD4+和CD8+T細胞的表達，也可以增強CD4+CD44+和CD8+CD44+效應T細胞的水平，且與ISA-206佐劑組沒有顯著差異；在安全性實驗中，發現含有ISA-206的疫苗組注射小鼠后，在注射部位有肉芽腫，而含有CDCP水佐劑的疫苗組沒有發現肉芽腫，初步表明了CDCP有良好的安全性，進一步的安全性需要開展相關實驗證實。

4 結論

CPCD不僅增強了體液免疫反應，還可以提高淋巴細胞的增殖水平，促進CD4+和CD8+T細胞亞群的水平，活化效應T細胞，在注射后沒有發現小鼠注射部位的肉芽腫，小鼠正常生長且沒有異常行為。這些研究結果為進一步開展CDCP作為FMDV疫苗的新型佐劑研究提供了基礎，也為多糖佐劑在其他疫苗中的應用提供了有益的參考。