生長激素釋放肽對糖尿病大鼠視網膜病變的保護作用

白 潔，張錦妹，劉麗蘋，王佳妮，孫 雯，楊 帆

0引言

研究顯示，我國糖尿病發病率約為3%～5%，糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病微血管病變中最重要的表現，其發病率大約占糖尿病患者的30%～60%，其病因與糖尿病患者胰島細胞代謝異常有關[1-2]。DR早期癥狀不明顯，伴隨病情進展，可出現視力下降、視物變形、眼前黑影飄動等癥狀，因此，早期治療非常重要。生長激素釋放肽(growth hormone releasing peptide，ghrelin)具有提高神經元存活率、調節細胞凋亡、抗炎、增強免疫力和抗氧化等生物活性。ghrelin已被證明是治療多種疾病的有效藥物，包括腦組織缺血再灌注、胃腸道間質瘤、糖尿病神經病變、心肌梗死和肺損傷等[3-4]。在我們之前的工作中，評估了ghrelin對人晶狀體上皮細胞的抗氧化作用，并證明它能夠吸收入血，通過血眼屏障，可能對白內障有治療作用[5]。既然ghrelin對晶狀體有保護作用，是否對眼部其他組織(視網膜)也能發揮保護作用呢，我們查閱了相關文獻，尚未找到關于ghrelin對視網膜組織保護作用的相關報道。本實驗中，我們進一步探索ghrelin對視網膜組織的保護作用，進一步為ghrelin作為臨床藥物在眼部組織的應用奠定理論基礎。

1材料和方法

1.1材料生長激素釋放肽(批號：MB11195，大連美侖生物技術有限公司)，高脂飼料(配方：基礎飼料+15%豬油+20%蔗糖+蛋黃3%，北京小黍有泰生物科技有限公司)，鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione Peroxidase，GSH-PX)活性檢測試劑盒丙二醛(malondialedhyde，MDA)活性檢測試劑盒(上海奧陸生物科技有限公司)，ELISA試劑盒(美國Abcam公司)，蘇木精和伊紅(HE)染色試劑盒(上海威奧生物科技有限公司)，TUNEL凋亡檢測試劑盒(美國abcam公司)、DAB顯色劑(上海朝瑞生物科技有限公司)，光學顯微鏡(Leica A60 S，德國徠卡公司)，透射電鏡(JEM-1000，日本電子株式會社),酶標儀(MR-96T，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)。

實驗動物及分組：清潔級健康SD雄性大鼠30只，體質量220±30g，購自哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，動物許可證號:SCXK(黑)2019-001，動物倫理委員會(Institutional Animal Careand Use Committee,IACUC)認證批準該研究方案。隨機分為正常對照組(普通飼料喂養)、模型組、ghrelin組，模型組和ghrelin組大鼠高脂飼料喂養4wk后，一次性腹腔注射鏈脲菌素60mg/kg，誘導糖尿病大鼠模型，正常對照組大鼠腹腔注射等劑量的生理鹽水。3d后用血糖儀測定尾靜脈空腹血糖，造模成功標準：72h后空腹血糖≥16.7mmol/L，造模成功后繼續高脂喂養6wk。模型組大鼠在注射鏈脲菌素后死亡4只，ghrelin組死亡3只。

1.2方法

1.2.1給藥方法每組各取6只大鼠進行后續實驗。ghrelin組每日1次給予ghrelin(100μg/kg)灌胃，對照組及模型組大鼠每日1次給予等體積0.9% Nacl注射液灌胃，連續給藥2wk。

1.2.2HE染色觀察大鼠視網膜組織病理形態學變化每組隨機取3只大鼠，摘除左側眼球后將部分視網膜組織用4%多聚甲醛固定2h，將5μm的視網膜切片置于載玻片上，梯度酒精沖洗后HE染色，光鏡拍攝圖像。視網膜厚度計算方法：自視網膜內界膜至視網膜色素上皮層垂直高度。

1.2.3TUNEL染色檢測大鼠視網膜細胞凋亡視網膜切片脫蠟后用二甲苯浸洗2次，酒精梯度脫水后加入TUNEL反應混合液，濕盒內孵育2h，甩干切片并入DAB顯色液，顯微鏡下觀察細胞核呈棕黃色的為TUNEL陽性，磷酸鹽緩沖液洗切片終止顯色，中性樹膠封片，光鏡拍攝圖像。

1.2.4透射電鏡每組取3只大鼠，摘除左側眼球后將視網膜組織用2%戊二醛固定24h，醋酸鈾溶液染色，乙醇-丙酮梯度溶液脫水，用檸檬酸鉛-醋酸鈾對制備視網膜的超薄切片(80nm)染色5min，透射電子顯微鏡觀察。

1.2.5檢測氧化應激指標及炎癥因子表達取6只大鼠右側視網膜組織，勻漿后按照試劑盒說明書檢測SOD、GSH-PX及MDA活性；另取部分視網膜用ELISA法檢測細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、腫瘤壞死因子-a(tumor necrosis factor-a，TNF-a)及白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的水平，酶標儀測定每孔在450nm處的OD值。

2結果

2.1SD鼠視網膜組織病理改變對照組視網膜組織完整，結構清晰；模型組視網膜厚度明顯降低，內、外核層細胞排布疏松；ghrelin組視網膜厚度較模型組增加，結構相對規整(圖1)。對照組、模型組、ghrelin組視網膜厚度分別為411.0±5.77、353.00±6.03、390.00±5.77μm，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組、ghrelin組與模型組視網膜厚度比較，差異均有統計學意義(t=6.948，P=0.002；t=4.433，P=0.011，圖2)。

圖1 大鼠視網膜組織病理改變(HE) A：對照組；B：模型組；C：ghrelin組。

圖2 三組視網膜厚度的比較 aP<0.05，bP<0.01 vs 模型組。

2.2視網膜TUNEL染色結果對照組大鼠視網膜感光細胞層偶見深棕色的TUNEL染色陽性細胞。模型組TUNEL染色陽性細胞數明顯增多。ghrelin干預后，TUNEL染色陽性細胞數量減少(圖3)。

圖3 大鼠視網膜TUNEL染色結果 箭頭所示為TUNEL染色陽性細胞。A：對照組；B：模型組；C：ghrelin組。

2.3視網膜色素上皮層透射電鏡觀察對照組細胞形態正常，細胞核呈圓形或橢圓形，細胞之間界限清晰。模型組細胞胞漿空泡化明顯，細胞膜不完整或破裂，可見大量空泡及脂滴。ghrelin干預后的細胞核和細胞質結構有所改善，細胞內仍有大量空泡存在(圖4)。

圖4 電鏡觀察RPE層超微結構 A：對照組；B：模型組；C：ghrelin組。

2.4鼠視網膜組織中SOD和GSH-PX及MDA相對表達量與對照組比較，模型組大鼠視網膜組織中SOD、GSH-PX活性降低，MDA含量升高(t=35.808、8.823、8.696，均P<0.05)；與對照組比較，ghrelin組大鼠視網膜組織中SOD、GSH-PX活性降低，MDA含量升高(t=15.410、6.710、11.770，均P<0.05)；與模型組比較，ghrelin組大鼠視網膜組織中SOD、GSH-PX活性升高，MDA含量下降，差異均有統計學意義(t=9.807、3.671、10.600，均P<0.05)，見表1。

表1 各組SD大鼠視網膜組織中SOD、GSH-PX及MDA相對表達量

2.5各組對大鼠視網膜組織炎癥因子水平的比較與對照組比較，模型組大鼠視網膜組織中炎癥因子ICAM-1、TNF-a及IL-1β表達均升高，差異有統計學意義(t=13.450、7.170、46.700，均P<0.05)；與對照組比較，ghrelin組大鼠視網膜組織中炎癥因子ICAM-1、TNF-a及IL-1β表達均升高，差異有統計學意義(t=7.723、6.197、9.634，均P<0.05)；與模型組比較，ghrelin組大鼠視網膜組織炎癥因子ICAM-1、TNF-a及IL-1β表達均降低，差異有統計學意義(t=6.813、6.183、5.767，均P<0.05)，見表2。

表2 各組SD大鼠視網膜組織炎癥因子水平的比較

3討論

隨著醫學技術的發展，糖尿病患者平均壽命延長，DR的發病率也隨之增加[6]。本實驗模擬人類2型糖尿病的發病機制，通過腹腔注射鏈脲佐菌素誘發機體高血糖，建立糖尿病大鼠模型，研究藥物對視網膜組織的保護作用。ghrelin是一種內源性腦腸肽，人體胃底細胞可以少量分泌，對人體安全、無毒，保證了藥物的安全性[3,7-8]。ghrelin可減少過氧化氫、高糖等多種病理刺激誘導的細胞凋亡[9]。ghrelin在眼部組織中的抗凋亡作用已有多個研究報道：Liu等[10]已經證實ghrelin可以通過抑制RGC-5細胞的凋亡和恢復線粒體功能來保護大鼠視網膜神經節細胞免受魚藤酮的傷害。Shimada等[11]測試了Des-ghrelin對人視網膜微血管內皮細胞的作用，發現Des-ghrelin可以通過減少ROS生成、增加抗氧化酶(MnSOD和CAT)的表達來減輕過氧化氫引起的損傷。但是，目前國內外尚未見關于ghrelin對視網膜保護作用的研究，本實驗以鏈脲菌素誘導的SD大鼠為模型，率先研究了ghrelin對糖尿病鼠視網膜組織的影響，在國內外屬于首創。

DR早期最主要的表現為視網膜組織及細胞的凋亡。我們采用了HE染色、TUNEL染色及透射電鏡三種形態學檢查方法觀察視網膜組織的病理結構變化。HE結果顯示，模型組大鼠視網膜變薄，組織結構不清晰，結構紊亂，神經節細胞數量減少，內、外核層細胞排列疏松，表明2型DR大鼠模型造模成功，ghrelin干預后，視網膜結構相對規整，細胞排列方式得到改善；TUNEL染色可標記早期的凋亡細胞，模型組視網膜內核層及外核層出現明顯染色陽性的凋亡細胞(深棕色類圓形)，而ghrelin組明顯降低，說明ghrelin干預能夠減輕糖尿病大鼠視網膜組織細胞的凋亡；此外，我們還通過透射電鏡對視網膜色素上皮層細胞進行了更微觀的觀察，以上觀察結果均提示，高糖破壞了視網膜組織正常結構，誘導細胞及組織凋亡，ghrelin可修復高糖誘導的視網膜病變。

控制DR的氧化應激損傷和炎性反應是治療DR的重要手段之一，機體長期高糖狀態使視網膜細胞處于氧化應激環境[12]。SOD、GSH-PX及MDA是氧化應激的標志性物質，ghrelin組SOD、GSH-PX活性升高，MDA含量顯著降低，說明ghrelin可以對抗氧化因子對視網膜的“攻擊”，降低了視網膜組織的氧化損傷。

炎性因子的表達水平與DR病情的嚴重程度正相關[13]。炎性細胞因子通過破壞血-視網膜屏障在DR患者視網膜內高表達，促進了DR的發生發展[14]。ICAM-1是介導黏附反應重要的黏附分子，近些年逐漸引起學者關注，ICAM-1不僅是疾病嚴重程度和解剖反應的生物標志物，而且可能是治療糖尿病性黃斑水腫的一個潛在靶點；TNF-α通過介導促進ICAM-1的表達介導炎癥反應，增加血管通透性，刺激視網膜血管內皮細胞增殖，誘導視網膜血流動力學異常，從而促進DR新生血管的形成；IL-1β參與免疫應答并促進微血管內皮細胞黏附分子的表達，增加缺血后中性粒細胞的黏附性和趨化性，損害血管內皮功能[15]。本實驗中，上述炎癥因子在ghrelin干預后均明顯降低，一方面證實了炎癥反應在DR中的參與作用，另一方面說明ghrelin可通過降低視網膜組織細胞炎性因子表達，緩解糖尿病大鼠視網膜病理變化的進程。

綜上所述，ghrelin治療糖尿病大鼠后，能有效延緩糖尿病大鼠視網膜病變的進程，其作用機制與降低氧化應激水平、抑制炎癥反應相關。本研究依然存在不足，尚缺乏體外細胞實驗進一步驗證ghrein對視網膜色素上皮細胞或視網膜血管內皮細胞作用的研究；另外，更深層次的機制學研究也需要探討。隨著研究內容的不斷深入，我們將從更深層次出發，對ghrelin的生物學功效進一步探討。