基于AMPK/SREBP-1c及PPARα信號通路的玳玳果黃酮調控脂質代謝作用機制研究

馬國萍，陳 丹，陳 紅，熊朝棟，余文靜

基于AMPK/SREBP-1c及PPARα信號通路的玳玳果黃酮調控脂質代謝作用機制研究

馬國萍1, 2，陳 丹1*，陳 紅2*，熊朝棟1，余文靜1

1. 福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122 2. 福建省立醫院 干部特診科，福建 福州 350001

探究玳玳果黃酮調控脂質代謝作用及其分子機制。建立預防性高脂血癥（hyperlipidemia）大鼠病理模型，以非諾貝特、辛伐他汀為陽性對照藥，考察玳玳果黃酮調控脂質代謝的作用，光鏡下觀察肝臟組織形態學；采用實時熒光定量RT-PCR法、Western blotting法檢測大鼠肝臟腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）、固醇調節元件結合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）及過氧化物酶增殖物激活受體α（peroxidase proliferators activate receptors α，PPARα）信號通路相關基因、蛋白的表達。預防性給藥玳玳果黃酮后，與模型組相比，各劑量玳玳果黃酮對高脂血癥大鼠血脂及肝臟脂肪變性均有明顯的改善作用（＜0.05、0.01）；可促AMPK磷酸化，使其mRNA及蛋白表達水平明顯升高（＜0.05、0.01）；顯著抑制并明顯下調SREBP-1c、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）、乙酰輔酶羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）蛋白和mRNA表達水平（＜0.05、0.01）；可促進PPARα、肉毒堿棕櫚酰基轉移酶-1（carnitine palmityl transferase-1，CPT-l）蛋白及mRNA表達水平升高（＜0.05、0.01）。玳玳果黃酮可有效改善脂質代謝紊亂，防治高脂血癥。其作用機制是通過激活AMPK促其磷酸化，從而抑制脂質合成，促進脂肪酸氧化分解，由此減少脂肪沉積，發揮調控脂質代謝的作用。

玳玳果黃酮；脂質代謝；腺苷酸激活蛋白激酶；固醇調節元件結合蛋白；過氧化物酶增殖物激活受體

現代社會隨著人口老齡化及生活和飲食習慣的改變，患高脂血癥（hyperlipidemia）的人群不斷增長，嚴重威脅人類健康。藥物治療是目前調控脂質代謝異常的主要方法，但臨床上使用的化學類調脂藥物存在諸多毒副作用。因此，尋找有效而低毒的調脂中藥，探討其調控脂質代謝的作用機制，具有十分重要的意義。玳玳L. var.Tanaka（Daidai）又稱代代，是蕓香科柑桔亞屬植物，酸橙的變種，未成熟果實稱玳玳花枳殼或蘇枳殼[1]；據《飲片新參》[2]記載：“玳玳性微寒，味苦、酸，有行氣寬中、消食、化痰的功能，藥食同源”。課題組前期研究表明，由玳玳果制備的有效部位提取物玳玳果黃酮[3]具有良好的調血脂、抗氧化作用[4-5]；該提取物的主要效應組分為新橙皮苷及柚皮苷，并已明確了藥效物質基礎和體內處置過程，經體內外質量評價，提取物組分群整體表征穩定[6-7]。

腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）是近年來發現的一種能量傳感器，被認為是調節細胞新陳代謝、調節脂肪含量、影響脂質代謝平衡的關鍵酶蛋白[8-9]。活化AMPK磷酸化，若激活下游分子通路信號，既可增加能量的分解代謝（如脂肪酸氧化分解代謝）又可能關閉合成代謝（如脂質的從頭合成途徑），是脂質代謝的2條重要通路[10-12]。固醇調節元件結合蛋白（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）和過氧化物酶增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated peceptor α，PPARα）分別是調控脂質從頭合成途徑與脂肪酸氧化分解代謝途徑中的重要的轉錄因子[13-16]，其下游的關鍵靶基因還包括乙酰輔酶羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthese，FAS）、肉毒堿棕櫚酰基轉移酶（carnitine palmitoyltransterase-1，CPT-l）等[17-19]。因此，為探究玳玳果黃酮調控脂質代謝機制，基于AMPK/SREBP-1c、ACC、FAS及PPARα、CPT-l調控脂質代謝的重要信號通路關鍵酶，以臨床上常用的調脂藥物非諾貝特（Fenofibrate）、辛伐他汀（Simvastatin）為陽性對照，通過預防性高脂血癥大鼠病理模型實驗方法，評價低、中、高劑量玳玳果黃酮調控脂質代謝作用，并進一步考察玳玳果黃酮是否通過激活AMPK促進其磷酸化（p-AMPK）上調，由此對其下游的脂質從頭合成途徑以及脂類氧化分解代謝途徑的靶基因和蛋白產生影響，闡釋玳玳果黃酮體現其整體作用的調控脂質代謝的多靶點分子作用機制，為玳玳果黃酮的研發提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

電泳轉模儀（美國Bio-Rad公司）；ChemiDocXRS＋化學發光成像系統（美國Bio-Rad公司）；C1000TMTermalcircle PCR儀（美國Bio-Rad公司）；ABI7900實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystem公司）；DM4000B LED光學顯微鏡（德國Leica公司）；Infinite M200 PRO多功能酶標儀（瑞士TECAN公司）；HFUU586超低溫冰箱（美國ThermoFisherScientific）等。

1.2 試藥

玳玳果黃酮[3]（自制，總黃酮質量分數85.83%，批號20171114）；辛伐他汀片（規格20 mg/片，批號H20171161，杭州默沙東制藥有限公司產品），非諾貝特膠囊（規格200 mg/粒，批號H20160155，法國利博福尼制藥公司）。總膽固醇（total cholesterol，TC，批號20180104）、三酰甘油（triglycerides，TG，批號20180605）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C，批號20180107）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C，批號20180317）等試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（批號20171216）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號080919190917）、增強型RIPA裂解液（批號080919180723）均購自碧云天生物科技有限公司；超敏ECL化學發光檢測試劑盒（批號20180904，蘇州宇恒生物技術有限公司）。RNA提取試劑盒（貨號R401-01）、RNA逆轉錄試劑盒（貨號R123-01）、CPT-1抗體（貨號15184-1-AP）均購自南京諾維贊生物科技公司；AMPKα抗體（貨號10929-2-AP）、ACC抗體（貨號21923-1-AP）、FAS/CD95抗體（貨號13098-1-AP）、SREBP1抗體（貨號14088-1-AP）、PPARα抗體（貨號15540-1-AP）、β-actin抗體（貨號66009-1-ig）、羊抗鼠IgG（H＋L）、羊抗兔IgG（H＋L）等均購自武漢三鷹生物技術有限公司；phospho-AMPK（Thr172）抗體（貨號bs-4002R，北京博奧森生物技術公司）。中性樹脂、組織包埋盒等購自索萊寶科技有限公司。

1.3 飼料

大鼠基礎飼料（福建中醫藥大學實驗動物中心）；高脂飼料（HD001，北京博泰宏達生物技術有限公司），總熱量比為4.7 kcal/grm，熱量百分比為蛋白質19.8%、碳水化合物35.2%、脂肪45.0%。

1.4 動物

清潔級SD大鼠，雄性，7～8周齡，56只，體質量（260±10）g（上海斯萊克實驗動物有限責任公司），實驗動物許可證號SCXK（滬）2017-0005。飼養環境溫度（24±4）℃，環境濕度（50±5）%，晝夜12 h交替，基礎飼料適應性喂養7 d。定點投喂，自由飲水，每日更換飲水及飼料。醫學實驗動物環境設施由福建中醫藥大學實驗動物中心提供，使用許可證號SYXK（閩）2014-0005。實驗操作均按照福建中醫藥大學動物倫理學委員會要求嚴格執行（批準號 [2018] 福中醫倫理審字第（031）號）。

2 方法

2.1 動物分組

大鼠隨機分為對照組、高脂血癥模型組、非諾貝特陽性對照組（Fen）、辛伐他汀陽性對照組（Sim）及玳玳果黃酮低、中、高劑量組，每組8只。

2.2 藥液制備

2.2.1 玳玳果黃酮藥液 精密稱取玳玳果黃酮適量，加0.5% CMC-Na生理鹽水，分別配制成質量濃度為0.012、0.024、0.036 g/mL的低、中、高劑量玳玳果黃酮藥液。

2.2.2 陽性藥液 非諾貝特膠囊臨用前配制成4 mg/mL的非諾貝特陽性藥液。辛伐他汀片臨用前配制成0.4 mg/mL的辛伐他汀陽性藥液。

2.3 給藥方案及造模

對照組大鼠基礎飼料喂養，模型組及各給藥組大鼠高脂飼料喂養。對照組和模型組大鼠以0.01 g/(kg·d) 劑量ig 0.5% CMC-Na生理鹽水。Sim組大鼠以0.004 g/(kg·d) 劑量ig辛伐他汀陽性藥液，Fen組以0.04 g/(kg·d) 劑量ig非諾貝特陽性藥液。玳玳果黃酮低、中、高劑量組大鼠分別以0.12、0.24、0.36 g/(kg·d) 劑量（參照課題組前期藥效學實驗結果[4]，按人體與鼠體表面積換算，從生藥量折算）ig玳玳果黃酮藥液。預防性給藥，模型組及各給藥組高脂飼料喂養的同時每天9:00～10:00 ig給藥1次，連續給藥45 d。大鼠自由飲水。

實驗期間，觀察大鼠的一般情況、飲食狀況、行為活動、精神狀態、毛發情況等，每天監測各組大鼠進食量。每周稱量各組大鼠體質量并記錄。直至45 d時，從對照組、模型組分別隨機取3只大鼠，眼眶取血，分離血清，檢測其中TG、TC、LDL-C、HDL-C含量，判斷高脂血癥模型是否制備成功。

2.4 標本采集

實驗結束，大鼠ip 2%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）麻醉后，腹主動脈采血，血液室溫靜置30 min后，3000 r/min離心15 min，分離血清。分離肝臟，稱質量并根據公式計算臟器指數。取部分肝臟組織，分裝于不同凍存管，置于液氮中速凍，再轉移至?80 ℃冰箱保存，用于相關基因、蛋白指標的測定。

臟器指數＝臟器濕質量/體質量

2.5 血清及肝臟脂質含量測定

取部分肝臟右葉組織制作勻漿，按相關試劑盒說明書提供的方法，分別測定大鼠血清、肝臟組織中TG、TC、LDL-C、HDL-C含量。

2.6 肝臟組織形態學觀察

取大鼠肝臟，肉眼觀察肝臟組織外觀形態及色澤。采用常規石蠟包埋、切片制片、HE染色，經脫水、透明、中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察肝臟組織的形態學病理變化。

2.7 大鼠肝臟組織相關指標mRNA相對表達量檢測

按試劑盒說明書步驟操作，提取大鼠肝臟組織總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。

實驗所用相關蛋白基因、、、、、等內參序列，由上海尚亞生物技術公司代為設計并合成引物（訂單編號SY805387）。引物序列見表1。

2.8 大鼠肝臟組織相關指標蛋白表達量檢測

取各組大鼠的肝臟組織，加入RIPA裂解液裂解勻漿，AMPK提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入AMPK、p-AMPK、SREBP-1c、ACC、FAS、PPARa、CPT-1抗體，4 ℃孵育過夜。室溫二抗孵育1～2 h。采用凝膠成像分析系統曝光條帶，使用 Image J 軟件對條帶進行定量分析。

表1 各引物序列

2.9 數據處理與統計學分析

3 結果

3.1 玳玳果黃酮對高脂血癥大鼠脂質代謝的影響

3.1.1 大鼠一般狀況與攝食量變化 給藥期間，各組大鼠均無死亡，對照組大鼠精神狀況良好，靈敏多動，皮毛整潔光亮，飲食飲水正常，大小便正常，體質量保持穩定增長。模型組大鼠反應較遲鈍，不活躍，常靜臥不動，毛色光亮，飲食飲水量及尿量明顯增多，部分大鼠大便稀軟異味重，體質量明顯增加；而玳玳果黃酮低、中、高劑量組及陽性對照組大鼠的一般狀況較模型組均有明顯改善。

實驗前3周，大鼠的攝食量逐漸增多，至實驗第5周后各組大鼠的攝食量趨于穩定，模型組總體攝食量水平高于對照組，對照組的攝食水平總體趨于穩定。陽性對照組及玳玳果黃酮各劑量組，實驗初期由于ig的刺激及藥物干預，攝食量有所下降，但在ig適應后各組的攝食量又恢復上升，且經造模后各組大鼠的體質量較造模前均明顯增加。結果見圖1。

圖1 各組大鼠攝食量變化

3.1.2 各組大鼠體質量、肝質量與肝指數變化 高脂飲食誘導造模45 d后，與對照組相比，模型組大鼠體質量、肝質量、肝臟指數均明顯增加（0.05）。與模型組比較，陽性對照組及玳玳果黃酮各劑量組大鼠體質量、肝質量、肝臟指數均不同程度明顯降低（＜0.05）。提示玳玳果黃酮的干預可不同程度降低大鼠的體質量、肝質量和肝臟指數，中劑量組和高劑量組表現尤為突出，高劑量組的降低作用與陽性對照組相近。結果見表2。

表2 給藥45 d后大鼠體質量、肝質量及肝臟指數 ()

與對照組比較：#＜0.05；與模型組比較：*＜0.05

#< 0.05control group;*< 0.05model group

3.1.3 對大鼠肝臟勻漿脂質含量影響 與對照組相比，模型組大鼠肝臟勻漿TG、TC、LDL-C含量均顯著升高，HDL-C含量均顯著降低（＜0.01），提示高脂血癥大鼠模型成功。與模型組相比，玳玳黃酮低、中、高劑量組及陽性對照組的大鼠肝勻漿TG、TC、LDL-C含量均顯著降低（＜0.01），HDL-C含量均顯著提高（＜0.01）。提示玳玳果黃酮表征出調控肝勻漿脂質積聚的作用，且呈劑量依賴性。其中，玳玳果黃酮中、高劑量組與陽性對照組效果相當；高劑量組調控TC、HDL-C的效果優于陽性對照組。結果見表3。

3.1.4 大鼠肝臟組織形態學變化 對照組大鼠肝臟顏色呈暗紅色，質地均勻，表面光滑，邊緣銳利，有韌性；模型組大鼠肝臟顏色呈偏黃泛白，表面明顯彌漫性腫大，邊緣較厚且多不規則，質脆并有油膩感，肝臟體積較其他組明顯增大，切面呈極為明顯花斑狀；與模型組相比，陽性對照組及玳玳果黃酮各劑量組大鼠的肝臟顏色呈現不同程度的灰紅色，其中Fen組的顏色趨于暗紅色，肝臟質地松軟，表面較光滑，有不同程度花斑；玳玳果黃酮組肝臟顏色、質地均有好轉，中、高劑量組好轉明顯。提示玳玳果黃酮具有改善肝組織脂質積聚作用。結果見圖2。

表3 玳玳果黃酮對大鼠肝臟脂質含量的影響()

與對照組比較：##＜0.01；與模型組比較：**＜0.01

##< 0.01control group;**< 0.01model group

圖2 各組大鼠肝臟形態

3.1.5 大鼠肝臟病理學組織切片觀察 對照組大鼠肝臟組織結構完整、清晰，肝小葉結構無異常，未發現肝細胞脂肪變性，肝細胞排列為以中央靜脈為中心呈放射狀，肝細胞內無脂滴分布。模型組大鼠肝臟出現重度彌漫性脂肪病變，肝小葉結構破壞，肝索排列紊亂，肝細胞體積增大，胞質疏松，胞漿內出現大小不等、數量不一的彌散性空泡狀脂滴，為典型的脂肪肝。與模型組相比，玳玳果黃酮各劑量干預后，大鼠肝細胞脂肪變性均呈現出不同程度的改善，胞漿內脂滴空泡數減少，體積變小；Fen組的肝細胞腫大和泡狀脂肪變性基本恢復正常，肝竇清晰可見，胞漿質豐富，細胞核位于肝細胞中央，與對照組大鼠肝組織結構基本一致，偶見脂滴；Sim組大鼠的肝細胞脂肪變性程度為輕度，胞漿內中等細小脂滴較少，脂滴泡不大，但仍有少量大脂滴。提示玳玳果黃酮對高脂血癥大鼠肝組織脂肪變性具有較明顯的改善作用，具有良好的調脂預防和治療作用，且呈劑量相關性。結果見圖3。

3.1.6 玳玳果黃酮對大鼠血清脂質含量的影響 與對照組相比，模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C含量顯著升高，HDL-C含量顯著降低，均具有極顯著性差異（＜0.01），提示高脂血癥大鼠模型造模成功。與模型組相比，玳玳果黃酮低、中、高劑量組及陽性對照組，大鼠血清TG、TC、LDL-C含量均顯著降低（＜0.05、0.01），HDL-C含量均顯著升高（＜0.05、0.01）。提示玳玳果黃酮具有調控血清脂質TG、TC、LDL-C、HDL-C含量的作用，效果與陽性對照藥相當，且呈一定的劑量相關性。其中，玳玳果黃酮降低血清TC含量水平趨勢明顯，調控HDL-C含量水平的效果優于辛伐他汀，而與非諾貝特相似。結果見表4。

圖3 肝臟病理組織切片圖(10×40倍鏡)

表4 玳玳果黃酮對大鼠血清脂質含量的影響 ()

與對照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group

3.2 玳玳果黃酮對高脂血癥模型大鼠肝臟AMPK mRNA和p-AMPK蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組大鼠肝臟mRNA及p-AMPK蛋白表達水平明顯降低（＜0.01）。與模型組相比，玳玳果黃酮中、高劑量組及Sim組的大鼠肝臟mRNA表達水平均明顯上調（＜0.01），且呈劑量相關性，玳玳果黃酮上調效果與陽性對照組相當，其中玳玳果黃酮高劑量組上調效果最佳。與模型組比較，玳玳果黃酮不同劑量組以及陽性對照組的大鼠肝臟p-AMPK蛋白表達水平明顯上調（＜0.05、0.01），玳玳果黃酮各劑量組表征的效果與陽性對照藥組相當。提示高脂飲食誘導高脂血癥可引起大鼠肝臟mRNA及p-AMPK蛋白表達水平下調；玳玳果黃酮、陽性對照藥辛伐他汀、非諾貝特均可使mRNA及p-AMPK蛋白表達水平明顯升高，可激活AMPK磷酸化。結果見圖4。

3.3 玳玳果黃酮對高脂血癥模型大鼠肝臟SREBP-1c、ACC、FAS蛋白和mRNA表達的影響

3.3.1 高脂血癥模型大鼠肝臟SREBP-1c蛋白和mRNA表達水平 與對照組相比，模型組大鼠肝臟SREBP-1c蛋白及mRNA表達水平均明顯升高（＜0.01）。與模型組相比，玳玳果黃酮不同劑量組及陽性對照藥組的大鼠肝臟SREBP-1c蛋白及mRNA表達水平均顯著降低（＜0.01），其中提取物高劑量組的抑制效果介于陽性對照Sim組與Fen組之間。提示玳玳果黃酮可顯著抑制高脂血癥大鼠肝臟SREBP-1c蛋白及mRNA表達水平。結果見圖5。

3.3.2 高脂血癥模型大鼠肝臟ACC蛋白和mRNA表達水平 與對照組相比，模型組大鼠肝臟ACC蛋白及mRNA表達水平明顯升高（＜0.01）。與模型組相比，玳玳果黃酮不同劑量組以及陽性對照藥組的大鼠肝臟ACC蛋白及mRNA表達水平均不同程度顯著降低（＜0.01），玳玳果黃酮各劑量組對大鼠肝臟mRNA表達的抑制效果介于陽性對照Sim組與Fen組之間；玳玳果黃酮高劑量組抑制大鼠肝臟ACC蛋白表達水平效果優于Sim組，與Fen組相當，并呈劑量相關性。提示玳玳果黃酮可使ACC蛋白及mRNA表達水平顯著降低，其中高劑量組與Fen組效果相當。結果見圖6。

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01

3.3.3 高脂血癥模型大鼠肝臟FAS蛋白和mRNA表達水平 與對照組相比，模型組大鼠肝臟FAS蛋白及mRNA表達水平升高（＜0.05、0.01）。與模型組相比，玳玳果黃酮各劑量組與陽性對照藥組的大鼠肝臟FAS蛋白及mRNA表達水平均明顯降低（＜0.05、0.01），其中玳玳果黃酮中、高劑量組及Sim組對大鼠肝臟FAS蛋白及mRNA表達水平下調顯著。提示玳玳果黃酮可顯著抑制高脂血癥大鼠肝臟FAS 蛋白及mRNA表達水平上調，使其在大鼠肝臟中表達水平明顯降低。結果見圖7。

3.4 玳玳果黃酮對高脂血癥模型大鼠肝臟PPARα、CPT-1蛋白和mRNA表達的影響

3.4.1 高脂血癥模型大鼠肝臟PPARα蛋白和mRNA表達影響 與對照組相比，模型組大鼠肝臟PPARα蛋白及mRNA表達水平明顯下調（＜0.01）。與模型組相比，玳玳果黃酮各劑量組及陽性對照藥組的大鼠肝臟PPARα蛋白及mRNA表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；玳玳果黃酮各劑量組升高大鼠肝臟PPARα蛋白及mRNA表達水平的效果明顯優于陽性對照組。提示玳玳果黃酮可明顯抑制高脂血癥大鼠肝臟PPARα蛋白及mRNA表達水平下調，使其表達水平顯著升高。結果見圖8。

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.4.2 高脂血癥模型大鼠肝臟CPT-1蛋白和mRNA表達水平 與對照組相比，模型組大鼠肝臟CPT-1蛋白及mRNA表達水平明顯降低（＜0.01）。與模型組相比，玳玳果黃酮各劑量組及陽性對照藥組的大鼠肝臟CPT-1蛋白及mRNA表達水平均顯著升高（＜0.01）；玳玳果黃酮各劑量組升高大鼠肝臟CPT-1蛋白及mRNA表達水平的效果與陽性對照藥基本相當。提示玳玳果黃酮可明顯抑制高脂血癥大鼠肝臟CPT-1蛋白及mRNA表達水平下調，使CPT-1蛋白及mRNA表達水平明顯升高。結果見圖9。

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01

4 討論

研究表明[10-11]，他汀類的代表藥物之一辛伐他汀可顯著降低體內TC和LDL-C水平，多用于高膽固醇癥治療，可通過激活AMPK，調節下游受體蛋白SREBP和PPARs的轉錄和表達，降低TC及膽固醇酯的生成，減少內源性脂肪酸的合成；非諾貝特是貝特類調脂藥物的代表，可顯著降低體內TG和LDL-C水平，同時也有增高HDL-C水平的作用，且作為PPARα配體的激活劑，可通過激活與其編碼相關的脂肪酸氧化蛋白基因，在轉錄水平誘導脂蛋白酶的表達，促進TG水解及脂肪酸氧化，減少肝臟中LDL的合成與分泌。故實驗選擇辛伐他汀與非諾貝特為陽性對照藥。

本研究采用預防性高脂血癥病理模型實驗方法評價玳玳果黃酮調控脂質作用。結果證實，玳玳果黃酮可顯著改善高脂血癥大鼠體質量及肝脂比等體征狀態；可有效降低高脂血癥大鼠血清及肝勻漿的TC、TG和LDL水平，提升HDL-C水平；病理學切片結果顯示，玳玳果黃酮可明顯改善大鼠脂肪肝組織病變，且均表現出良好的劑量相關性。提示玳玳果黃酮具有良好的防治高脂血癥的作用，可有效調控改善脂質代謝紊亂，且對TC、HDL-C水平的調控效果尤為顯著。

AMPK是機體能量代謝的關鍵性蛋白靶點，SREBP-1c主要分布在肝臟、脂肪組織及大鼠骨骼肌中，可促進脂質轉錄合成，影響相關靶點ACC、FAS等表達，SREBP-1c的過度表達將引起脂質代謝紊亂，而激活AMPK可下調SREBP-1c的表達，從而抑制TG和脂肪酸的合成[12-16]。PPARα主要在肝臟、腸道及心臟組織中高表達，能誘導肝臟的線粒體脂肪酸氧化的限速酶CPT-1表達，AMPK激活后蛋白磷酸化，可上調PPARα和CPT-l的表達，增強線粒體對脂肪酸的利用和氧化[16-19]。預試驗表明，玳玳果黃酮調控脂質作用與AMPK存在量效關系，并表征出多靶點的特性。故實驗提出基于AMPK，探究玳玳果黃酮調控脂質作用與AMPK及其下游信號通路靶點SREBP-1c、ACC、FAS及PPARα、CPT-l信號通路的相關性，闡釋其調控脂質代謝的作用靶點、通路及機制。

本研究結果表明，高脂飲食誘導高脂血癥模型大鼠可引起肝臟mRNA和p-AMPK蛋白表達水平下調，使SREBP-1c、ACC和FAS的蛋白及mRNA表達均明顯升高，PPARα、CPT-1的蛋白和mRNA表達水平均明顯降低。預防性給藥玳玳果黃酮后，可顯著激活大鼠肝臟組織的AMPK，促使其磷酸化，使mRNA和p-AMPK蛋白表達水平明顯升高，顯著下調和抑制SREBP-1c、FAS、ACC的蛋白和mRNA表達；同時，明顯促進PPARα、CPT-1蛋白和mRNA表達水平的顯著提升。

綜上所述，玳玳果黃酮可通過激活AMPK促其磷酸化，從而抑制AMPK下游信號通路轉錄因子SREBP-1c表達，進而調控抑制下游脂質生成相關靶點FAS、ACC表達，抑制脂質從頭合成，降低肝臟脂質的生成；同時，玳玳果黃酮的干預可上調脂質代謝信號通路關鍵酶PPARα蛋白及mRNA表達，從而進一步調控增加下游脂質代謝相關酶CPT-1的表達，提高酶活性，促進脂肪酸氧化分解；由此起到調控改善脂質代謝紊亂，減少脂質沉積的作用。該研究結果也為探究中藥多靶點協同調控脂質代謝作用提供了有益的研究思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Studies on mechanism of lipid metabolism regulation ofvar.flavonoids extract based on AMPK/SREBP-1 and PPARα pathway

MA Guo-ping1, 2, CHEN Dan1, CHEN Hong2, XIONG Chao-dong1, YU Wen-jing1

1. Department of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China 2. Cadre Special Department, Fujian Provincial Hospital, Fuzhou 350001, China

To explore the lipid metabolism regulation effect and molecular mechanism of flavonoids from Daidai (L. var.Tanaka) fruit.The hyperlipidemia (HLP) rat pathological model was established, and Fenofibrate and Simvastatin were used as positive control drugs to explore the effect of different doses of flavonoids from Daidai fruit on the regulation of lipid metabolic mechanism. The morphology of liver tissues was observed by light microscope. Real-time quantitative PCR (qRT-PCT) and Western blotting were used to measure the mRNA and the protein levels that are related to adenosine monophosphate activated protein kinase (AMPK), sterol regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c), and peroxidase proliferators activate receptors α (PPARα) signal pathway of rat liver tissues respectively.As compared to the model group, the result showed dose dependency after preventive administration of flavonoids from Daidai fruit, each dose of flavonoids from Daidai fruit were significantly able to improve blood lipid and liver steatosis in the hyperlipidemia rats (< 0.05, 0.01); promote the phosphorylation of AMPK, and increase the levels of mRNA and protein expression for AMPK significantly (< 0.05, 0.01); significantly inhibit and down-regulate the levels of mRNA and protein expression for SREBP-1c, fatty acid synthase (FAS), and acetyl CoA carboxylase (ACC) (< 0.05, 0.01); increase the levels of mRNA and protein expression for PPARα and carnitine palmityl transferase-1 (CPT-1) (< 0.05, 0.01).The flavonoids from Daidai fruit can effectively improve lipid metabolism disorder and prevent hyperlipidemia. Its mechanism of action is to activate AMPK to promote its phosphorylation, which inhibits lipid synthesis and promotes the oxidative decomposition of fatty acids, thereby reducing fat deposition and regulating lipid metabolism.

flavonoids ofvar.fruit; lipid metabolism; adenosine monophosphate activated protein kinase; sterol regulatory element binding protein-1c; peroxidase proliferators activate receptors α

R285

A

0253 - 2670(2021)21 - 6598 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.018

2021-04-15

福建省自然科學基金項目（2018J01253）；福建省醫學創新項目（2016-CX-45）；福建省科技計劃項目（2010Y2004）

馬國萍（1992—），女，碩士，研究方向為中藥藥效物質基礎及質量評價。Tel: 18344980693 E-mail: 1342341856@qq.com

陳 丹（1961—），女，博士，教授。Tel: 13515026709 E-mail: 2536282060@qq.com

陳 紅（1966—），女，學士，主任醫師。Tel: 18950339443 E-mail: chyed@sina.com

[責任編輯 潘明佳]