巴西橡膠樹氰丙氨酸合成酶基因HbCAS的克隆與表達分析

張議文 劉輝 馮成天 胡義鈺 王真輝 袁坤

摘? 要：氰丙氨酸合成酶（β-cyanoalanine synthase，β-CAS）是植物氰化物解毒的關鍵酶，在調節植物生長發育及逆境脅迫中扮演重要角色。本研究從巴西橡膠樹中克隆氰丙氨酸合成酶基因HbCAS，并對其進行分析。結果表明：HbCAS基因開放閱讀框長為1113 bp，編碼370個氨基酸，其理論分子量為40.15 kDa，等電點為8.90，屬于色氨酸合成酶超家族。實時熒光定量PCR分析結果顯示，HbCAS基因在橡膠樹各種組織中均有表達，其中在膠乳中的表達量最高。同健康樹相比，HbCAS基因在死皮樹中的表達顯著下調。過氧化氫及乙烯利、茉莉酸甲酯、水楊酸及脫落酸等多種激素均能調控HbCAS基因的表達。同時，HbCAS基因的表達也受干旱、低溫、甲基紫精、高鹽等多種非生物脅迫調節。本研究結果揭示HbCAS基因可能在橡膠樹死皮發生、活性氧信號、激素調節及多種非生物脅迫應答中起重要作用。

關鍵詞：巴西橡膠樹;氰丙氨酸合成酶;死皮;脅迫應答

中圖分類號：S794.1????? 文獻標識碼：A

Cloning and Expression Analysis of a β-cyanoalanine Synthase Gene HbCAS in Hevea brasiliensis

ZHANG Yiwen1， LIU Hui2， FENG Chengtian2， HU Yiyu2， WANG Zhenhui2， YUAN Kun2*

1. College of Tropical Crop， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： β-cyanoalanine synthase （β-CAS）， a key enzyme involved in cyanide detoxification in plants， plays an important role in regulating the growth and development and stress response. In this study， HbCAS was cloned from H. brasiliensis. The results indicated that HbCAS had an open reading frame （ORF） of 1113 bp， encoding 370 amino acids with a theoretical molecular weight 40.15 kDa and an isoelectric point of 8.90， belonging to the superfamily of tryptophan synthase beta. Quantitative real-time PCR analysis showed HbCAS was found to express in all tested tissues with the highest expression in latex. Compared with the healthy trees， HbCAS expression significantly decreased in the tapping panel dryness （TPD） infected trees. Hydrogen peroxide （H2O2） and various hormones of ethephon （ETH）， Methyl jasmonate （MeJA）， salicylic acid （SA） and abscisic acid （ABA） all regulated the expression of HbCAS. Meanwhile， HbCAS expression was regulated by diverse abiotic stresses of drought， low temperature， methyl viologen and high salt. These results suggest that HbCAS might play key roles in TPD onset， reactive oxygen species signaling， hormone regulating， as well as various abiotic stresses responses.

Keywords： Hevea brasiliensis; β-cyanoalanine synthase; tapping panel dryness; stress response

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.003

氰丙氨酸合成酶（β-cyanoalanine synthase，β-CAS）是植物降解氰化物的關鍵酶。生氰糖苷又稱為氰苷，是植物的次生代謝產物，含有生氰糖苷的植物為生氰植物。當植物遭受外界脅迫時，生氰糖苷會與其降解酶接觸發生酶促水解反應，釋放出有毒物質氫氰酸（HCN）[1-3]。為了控制植物細胞內氰化物的濃度，植物利用β-CAS進行解毒。β-CAS以HCN和半胱氨酸為底物催化合成β-氰丙氨酸，氰丙氨酸進一步被轉化為天冬酰胺[3]。

β-CAS廣泛存在于植物中。在擬南芥中有3個編碼β-CAS的基因，分別為CYS-C1、CYS-D1和CYS-D2[4]，在煙草中有2個編碼β-CAS的基因[5-6]。已有研究表明，β-CAS參與多種生物學過程，其活性受病原及環境脅迫等調節。擬南芥AtCysC1參與了對病原菌的應答[7]。干旱脅迫能顯著提高煙草葉片和根中β-CAS活性，復水后其活性下降[5]，過表達β-CAS的煙草植株增加了對鹽脅迫的耐性，而β-CAS基因沉默植株則更易遭受氧化脅迫損傷[6]。此外，β-CAS還參與了根毛形成、種子發芽等過程[8-9]。

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）是天然橡膠的主要來源，具有重要的經濟價值，但橡膠樹死皮卻嚴重降低了膠園產量。橡膠樹是典型的生氰植物，細胞質基質中含有生氰糖苷[10]和β-CAS[11]。已有研究顯示，正常樹中β-CAS酶活性很高[11]，而死皮植株中β-CAS酶活性極低[12-14]。β-CAS可能在調節橡膠樹死皮發生過程中扮演重要角色，但目前關于橡膠樹β-CAS基因的功能研究還未見報道。本研究對橡膠樹HbCAS基因進行了克隆，并對其編碼的蛋白進行多序列比對及系統進化分析，同時，采用實時熒光定量PCR技術對HbCAS基因在不同組織及不同處理條件下的表達模式進行系統分析，從而為進一步闡明HbCAS基因在橡膠死皮發生中的功能奠定理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究所用的實驗材料為巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）品系‘熱研7-33-97，該品系于1991年定植在中國熱帶農業科學院試驗農場。采集‘熱研7-33-97穩定葉、衰老葉、雌花、雄花、膠乳、樹皮、新梢等組織樣品，其中根部組織樣品取自移栽培養6個月的‘熱研7-33-97組培苗，于?80 ℃保存備用。各組織樣品包含3個生物學重復，每個重復選取3棵樹。

選取長勢相同的‘熱研7-33-97組培苗進行過氧化氫（H2O2）、乙烯利（ETH）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水楊酸（SA）、脫落酸（ABA）、甲基紫精（MV）、干旱處理（PEG）、低溫處理（cold）及高鹽脅迫（salt）處理。H2O2的處理參照Zhu等[15]的方法，處理濃度為20 mmol/L;ETH和MeJA的處理參照Hao等[16]的方法，處理濃度分別為10 mmol/L和200 μmol/L;ABA、SA和MV處理濃度分別為200 μmol/L、5 mmol/L和200 μmol/L。低溫處理是將組培苗置于人工氣候箱中，處理溫度為4 ℃，光照強度600 μmol/（m2·s），光照時間為16 h;將組培苗的培養基質洗凈，根部浸泡于20%聚乙二醇6000（PEG6000）中來模擬干旱環境;采用400 mmol/L NaCl處理來模擬高鹽脅迫條件。以不做任何處理的組培苗為對照，分別在處理后3、6、12、24、48 h時采集葉片，用液氮凍存，用于RNA提取。

1.2? 方法

1.2.1? 總RNA提取、反轉錄及HbCAS基因克隆? 膠乳提取方法參照天根（TIANGEN）公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書，其他不同組織RNA的提取方法參照BioTeKe通用植物總RNA提取試劑盒說明書。參考反轉錄試劑盒（TaKaRa Prime Script? RT reagent Kit with gDNA Eraser）說明書去除RNA里混雜的少量DNA，并按照步驟合成第一鏈cDNA。

根據擬南芥β-CAS基因序列搜索橡膠樹基因組數據庫，獲得與其相似的序列scaffold0194_ 110039，采用Primer3（http：//primer3.ut.ee/）軟件設計特異性引物，HbCAS-F：5?ACTGTGGAG TGTGGGAAGAG?3，HbCAS-R：5?ACCCCATC CCAAAGCACTTA?3。以橡膠樹‘熱研7-33-97膠乳cDNA為模板，用PCR擴增目標基因，擴增體系為：cDNA模板5 μL，5×TransStart? FastPfu Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.75 μL，TransStart? FastPfu DNA Polymerase （2.5 U/μL） 0.5 μL，加入ddH2O至總體積為25 μL。PCR程序如下：95 ℃ 1 min;95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環。將PCR產物與1 μL pEASY?-Blunt Simple Cloning Vector進行連接，加連接產物于50 μL Trans1-T1感受態細胞，鑒定為陽性的克隆送上海鉑尚生物技術有限公司測序。

1.2.2? HbCAS基因序列與生物信息學分析? 采用NCBI數據庫中ORF finder（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/orffinder/）查找HbCAS基因的ORF（開放閱讀框）區，推導出其編碼的氨基酸序列;通過在線軟件ExPASy的ProtParam（https：//web. expasy.org/protparam/）分析蛋白質的理論分子量和等電點;使用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi？）分析HbCAS基因編碼蛋白序列保守結構域;利用Signal P 4.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM Server V.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/）預測HbCAS基因編碼蛋白序列的信號肽和跨膜域;使用DeepLoc1.0（http：// www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/）預測HbCAS基因編碼蛋白的亞細胞定位;蛋白序列比對分析采用NCBI SmartBlast工具，選取與HbCAS蛋白同源的其他植物CAS蛋白序列，利用DNAMAN軟件做多序列比對分析，利用MEGA 6.0軟件，采用鄰接法Neighbor-Joining構建HbCAS蛋白的系統進化樹。

1.2.3? 實時熒光定量PCR分析? 根據測序結果設計HbCAS基因的實時熒光定量PCR的引物。HbCAS-qF：5?TAATCACTCCCGGGAAGACG-，HbCAS-qR：5?GTCACCCTTCTCTCCAAGCT?3，以橡膠樹UBC4基因（GenBank登錄號：HQ323249.1）為內參基因，設計特異引物，HbUBC4-qF：TCACCCTGAACCTGATAGCC，HbUBC4-qR：TTTCTTTGGTGACGCTGCAA對相應模板進行擴增。

1.3? 數據處理

實驗所得數據采用SAS軟件進行統計分析，使用Origin 2018軟件進行數據處理和圖表制作，基因相對表達量結果為3次生物學重復的平均值±標準誤。

2? 結果與分析

2.1? HbCAS基因克隆與序列分析

用擬南芥的CAS序列對橡膠樹全基因組數據庫做同源比對，獲得具有完整ORF的基因序列。在該序列的ORF兩端設計特異性引物，采用PCR技術從膠乳cDNA中擴增出的條帶與預期片段大小一致（圖1）。測序結果顯示，該片段長度為1164 bp，ORF長1113 bp。由圖2可知，HbCAS蛋白編碼370個氨基酸，預測其理論分子量為 40.15 kDa，等電點為8.90。序列分析結果表明，HbCAS基因編碼蛋白不具有信號肽和跨膜結構域，主要定位于線粒體，屬于色氨酸合成酶（tryptophan synthase beta）超家族。核苷酸序列比對顯示，該基因屬于CAS家族，將其命名為HbCAS。

2.2? HbCAS蛋白系統進化分析

選取木薯、麻風樹、棉花、木槿、可可等10個CAS蛋白與橡膠樹HbCAS蛋白進行多序列比對分析，結果表明（圖3），HbCAS蛋白與木薯MeCAS氨基酸同源性最高，相似性達91%，其次是麻風樹JcCAS蛋白，相似性為90%。進一步利用MEGA 6.0軟件將HbCAS蛋白與18個其他物種的CAS蛋白進行系統進化分析，結果表明（圖4），HbCAS蛋白與木薯MeCAS、麻風樹JcCAS親緣關系較近，而與葡萄VvCAS、扁桃PdCAS、大麻CsCAS、苦瓜McCAS等親緣關系較遠。

2.3? HbCAS基因的組織表達特性分析

實時熒光定量分析結果表明（圖5），HbCAS基因在巴西橡膠樹膠乳、樹皮、根、穩定葉、衰老葉、雄花、雌花和新梢等組織中均有表達，其中在膠乳中的表達量最高，顯著高于在其他組織中的表達量。除膠乳外，HbCAS基因在衰老葉和雄花中的表達量也相對較高，均顯著高于在樹皮、根、穩定葉、雌花和新梢中的表達，且HbCAS基因在衰老葉中的表達量顯著高于雄花;HbCAS基因在樹皮、根、穩定葉和雌花中的表達量相對較低，且差異不顯著，在樹皮、雌花和新梢中的表達也無顯著差異。

2.4? HbCAS基因在不同處理下的表達分析

同健康樹相比，HbCAS基因在死皮樹膠乳中的表達量顯著降低（圖6）。經脅迫和激素處理后，HbCAS基因的表達均被調節（圖7）。在H2O2、MV和低溫處理下，HbCAS基因在葉片中的表達量均呈先降低后升高再降低的趨勢，其中H2O2和MV處理6 h時，HbCAS基因表達量升高至處理前的2倍左右，達到最大值，6 h后開始顯著下降;低溫處理3 h和24 h時，HbCAS基因表達量降至最低，48 h后顯著升高;在高鹽、干旱及乙烯利脅迫下，HbCAS基因的表達量整體呈現上升的趨勢，均在48 h顯著升高到最高值;MeJA處理下，HbCAS基因表達量整體呈現波動趨勢，處理6 h降至最低，約為處理前的1/3;HbCAS基因表達量在SA處理下呈先降低后升高再降低的趨勢，處理后12 h表達量最高，約為處理前的2倍，處理后48 h降至處理前的1/2左右;在ABA的處理下，HbCAS基因表達量在處理后3 h升高至最高值，然后呈逐漸下降的趨勢，48 h表達量顯著降至最低值。

3? 討論

β-CAS是植物體內氰化物解毒的關鍵酶，在調節植物生長發育及逆境脅迫中扮演重要角色。本研究從橡膠樹中克隆了HbCAS基因，該基因編碼蛋白與同屬大戟科植物的木薯、麻風樹CAS蛋白具有較高的序列同源性和較近的親緣關系，這表明CAS蛋白在進化上高度保守。

HbCAS基因在膠乳、樹皮、根、穩定葉、衰老葉、雄花、雌花和新梢等組織中均有表達，其在膠乳中的表達量最高，暗示了該基因可能在膠乳中具有關鍵功能。同健康樹相比，HbCAS基因的表達在死皮樹膠乳中受到明顯抑制。有研究顯示[12-14]，死皮樹中β-CAS酶活性顯著降低，這與本研究結果類似，暗示了死皮樹中氰化物解毒能力下降可能與橡膠樹死皮發生有關。

活性氧作為信號分子可調控植物不同的代謝反應，當植物受到逆境脅迫時會大量產生活性氧，導致活性氧的過度積累，從而造成細胞死亡，影響植物正常的生長發育[17-20]。橡膠樹死皮發生也被認為與活性氧信號密切相關[21-22]。在本研究中，活性氧處理顯著調節了橡膠樹HbCAS基因的表達，暗示了HbCAS基因可能通過參與H2O2信號途徑進而調節死皮的發生。生產上通過乙烯利刺激來增加膠乳產量。本研究發現，乙烯利刺激顯著上調了HbCAS基因的表達，暗示了HbCAS基因可能在乙烯調節的膠乳產生中發揮作用。HbCAS基因的表達也被MeJA、SA和ABA等激素調控，說明HbCAS基因參與了MeJA、SA和ABA等多種激素信號的應答。

此外，HbCAS基因的表達也受多種非生物脅迫調節，如甲基紫精、干旱、低溫及鹽脅迫等。Yu等[6]發現在煙草中過量表達β-CAS基因能增加植株對鹽脅迫的耐性。本研究顯示，鹽脅迫顯著上調了HbCAS基因的表達，推測HbCAS基因可能在橡膠樹鹽脅迫應答中具有重要功能。干旱脅迫下，HbCAS基因的表達顯著上調，Liang等[5]也發現干旱脅迫顯著上調煙草葉片和根中β-CAS活性，這與本研究結果類似，暗示了CAS基因參與了干旱脅迫應答。

綜上所述，本研究從巴西橡膠樹中克隆了HbCAS基因，該基因ORF長為1113 bp，編碼370個氨基酸。HbCAS基因具有組織特異性表達，在死皮樹中表達明顯下調。H2O2及乙烯利、MeJA、SA和ABA等多種激素調節了HbCAS基因的表達，同時，干旱、低溫、甲基紫精、高鹽等多種非生物脅迫也調控了HbCAS基因的表達。這些結果暗示了HbCAS基因可能在橡膠樹死皮發生、活性氧信號、激素調節及多種非生物脅迫應答中扮演重要角色。本研究為進一步闡明HbCAS基因在橡膠樹死皮發生中的功能奠定了理論基礎。

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責任編輯：黃東杰